‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

‘黄冠’梨类甜蛋白编码基因PbPR5的克隆及其表达特性分析

【目的】分离和克隆类甜蛋白基因Pb PR5,了解其在‘黄冠’梨不同组织、不同发育阶段以及受到非生物胁迫和植物生长调节剂处理时的表达情况。【方法】以‘黄冠’梨(Pyrus bretschneideri‘Huangguan’)组培苗为试验材料,从水杨酸(salicylic acid,SA)处理的c DNA文库中克隆获得该基因全编码区序列,命名为Pb PR5,对其进行生物信息学分析,并研究该基因在盐、聚乙二醇(EG6000)、SA和乙烯(ETH)处理后的表达情况;以12 a生‘黄冠’梨的叶片和果实为材料,探究该基因在叶片和果实不同发育阶段的表达模式。【结果】Pb PR5的c DNA序列长度为741 bp,编码224个氨基酸残基;该基因的基因组DNA序列长度为813 bp,包含1个内含子。生物信息学分析表明,Pb PR5蛋白与其他植物PR5基因编码的氨基酸序列相似性较高。实时荧光定量PCR分析表明:Pb PR5基因在‘黄冠’梨组培苗的根,茎,叶中均能表达,其中根部的表达量高于茎和叶;盐和干旱胁迫诱导了该基因表达,根和茎中的表达高峰均出现在处理后6 h,叶在盐胁迫后24 h和干旱后12 h出现表达高峰;SA和乙烯也诱导了该基因在叶片中的表达。在不同发育阶段的叶片中,老叶表达量最高,成熟叶次之,幼叶中不表达;在不同发育阶段的果实中,成熟果实中表达量最高,幼果期和膨大期果实表达量较低。【结论】Pb PR5基因在‘黄冠’梨各组织中非组成型表达,并且在‘黄冠’梨抵御生物和非生物胁迫过程中可能具有重要的生物学功能。     

白菜NRT2基因的克隆及表达模式分析

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为试材,采用RT-PCR技术,获得1个高亲和硝酸盐转运蛋白基因（NRT2）的cDNA序列,全长1 593 bp,推断其编码530个氨基酸,命名为BcNRT2。序列分析表明：BcNRT2基因与甘蓝型油菜BnNRT2基因和拟南芥AtNRT2.1基因核苷酸序列的相似性分别为98%和90%,氨基酸序列的相似性分别为99%和95%,表明植物中NRT2基因保守度较高。实时定量PCR表达分析表明,BcNRT2在白菜根部的表达量最高,为诱导型表达。低浓度NO^₃-（0.2 mmol · L^-1 KNO₃）处理0.5 h后其表达量迅速上升,BcNRT2可能为NO₃^-感受器。高浓度NO₃^-（20 mmol · L^-1 KNO₃）处理后其表达量更高,持续时间较长,可能是受到低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1.1的调控而产生的高水平响应。原生质体的瞬时表达显示,BcNRT2蛋白位于细胞膜上。     

黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

 以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1 011 bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2 h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12 h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4 h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析

以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料，采用 PCR 技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子 CsICE 的开放阅读框，长度 783 bp。采用荧光定量 PCR 分析 CsICE 的表达量，结果表明 CsICE 在根、茎、叶、花和果中都有表达，在叶中表达量最高，是根、茎、果中表达量的 4 倍；在 500 μmol L-1ABA 处理下，幼叶中 CsICE 表达峰值是对照的 40 倍，在 4 ℃低温处理下，最高值是对照的 20 倍，在 10%聚乙二醇 6000 处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的 5 倍。亚细胞定位结果显示 CsICE 定位在细胞核上。     

野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIP1的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从中国野生毛葡萄（Vitis heyneana）‘花溪–9’根中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水通道蛋白基因,命名为VhPIP1（登录号为KM026528）。该基因cDNA全长为1 087 bp,包含1个858 bp的完整开放阅读框,编码286个氨基酸。氨基酸序列分析表明,VhPIP1含有水通道蛋白家族高度保守的两个NPA（Asn-Pro-Ala）单元和6个跨膜区,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。实时荧光定量RT-PCR分析表明,VhPIP1在野生毛葡萄根、茎、叶中均有表达,在根中的表达量最高,叶片中最少。干旱胁迫下,抗旱性强的毛葡萄‘花溪–9’VhPIP1的表达量随着胁迫时间的延长先增加后降低,而不抗旱的欧亚种‘红地球’VvPIP1的表达量呈下降的趋势。与不抗旱的‘红地球’相比,干旱胁迫下极抗旱的‘花溪–9’较高的VhPIP1转录水平对应较高的叶片相对含水量,同时对应较低的根系细胞膜相对透性。VhPIP1的表达丰度与毛葡萄抗旱性密切相关。     

大岩桐SsKN1基因的克隆及组织表达分析

以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。     

中国山葡萄‘双红’胺氧化酶(amine oxidase)基因的抗霜霉病研究

【目的】探究高抗霜霉病的中国山葡萄‘双红’中胺氧化酶(VaAO)在抗葡萄霜霉病中的作用。【方法】以中国山葡萄‘双红’为试材,采用RT-PCR技术,克隆山葡萄‘双红’的AO基因,命名为VaAO;利用RT-qPCR在转录水平上分别检测了抗病的山葡萄‘双红’和感病的欧亚种葡萄‘赤霞珠’接种霜霉菌后AO的表达模式;通过农杆菌介导的瞬时转化法,使VaAO分别在本氏烟草和葡萄‘赤霞珠’中瞬时过表达;利用DAB染色法,检测H_2O_2的积累。【结果】VaAO基因的开放阅读框(ORF)长2 184 bp,编码727个氨基酸。经BLAST比对发现VaAO氨基酸序列与欧亚种葡萄‘黑比诺’的氨基酸序列同源性高达99%。定量结果表明:抗病的‘双红’和感病的‘赤霞珠’的AO基因均受到霜霉菌诱导,且相对表达量都在接种72 h后达到最高峰。值得注意的是,VaAO在接种后24 h表现出显著上调。VaAO在烟草中瞬时表达后发现其蛋白定位在细胞核和细胞膜中。VaAO在‘赤霞珠’叶片中瞬时过表达能够显著提高叶片中H2O2的积累和抵抗霜霉病的能力。【结论】成功克隆了山葡萄‘双红’的VaAO基因,定量分析和瞬时表达均表明VaAO基因在参与葡萄抗霜霉病的过程中发挥了重要作用。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

多年生黑麦草P5CS基因的cDNA克隆、表达及亚细胞定位

以多年生黑麦草(Lolium perenne)‘Derby'为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因(P5CS)的cDNA序列,全长2528bp,推断其编码716个氨基酸,命名为LpP5CS。序列分析表明:LpP5CS基因与小麦TaP5CS和水稻OsP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为92.05%和85.82%,氨基酸序列的相似性分别为93.99%和87.99%。半定量PCR结果表明,LpP5CS基因在多年生黑麦草根、茎,叶均有表达。盐处理下,表达量高于对照,其中叶片中表达量最高,根中最低。200mmol·L-1NaCl处理下,LpP5CS基因表达量随处理时间延长,有先升高后降低的趋势。洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示,LpP5CS蛋白定位于细胞膜和细胞核。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

红穗和白穗醋栗F3H的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析

以红穗醋栗（Ribes rubrum L.）和白穗醋栗（R. albrum L.）果实为试材,采用RACE方法克隆黄烷酮3–羟化酶（F3H）基因cDNA全长序列,分别命名为RrF3H和RaF3H（KU984435和KU984436）。RrF3H全长1 351 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸;RaF3H全长1 291 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸。氨基酸多序列比对表明该基因编码的蛋白具有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。系统发育分析表明,RrF3H和RaF3H在进化上具有明显种属特性,属于相对独立的进化分支。定量PCR分析表明,F3H在红穗醋栗中表达量远远高于白穗醋栗,在红穗醋栗中随着果实着色加深表达量逐渐上升,果实着色约75%时表达量最高,之后下降;白穗醋栗中随着果实生长,该基因的表达下降,花色苷含量也呈下降趋势,说明F3H基因在醋栗果实着色过程中发挥作用。     

梨贝壳杉烯酸氧化酶基因PcKAO1 的克隆与表达分析

 以梨矮化砧木‘中矮1 号’新梢叶片为试材,根据苹果基因组中相关序列信息设计特异引 物,通过RT-PCR 的方法克隆了梨赤霉素合成过程中关键酶--贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）基因的编码 框全长序列。该序列全长1 568 bp,开放阅读框（ORF）编码503 个氨基酸,相对分子量为57.59 kD,等 电点为9.47,氨基酸序列与其它物种已知的KAO 序列具有53.14% ~ 98.61%的相似性,且具有细胞色素 P450 家族蛋白典型的功能结构域和跨膜结构域,将该基因命名为PcKAO1,GenBank 登录号为 KC153027.1。用同样的方法克隆了对照梨品种‘早酥’（乔化）和‘锦香’（半矮化）的PcKAO1 基因, 通过比对分析发现3 个品种的PcKAO1 基因间仅有个别碱基差异,其编码的蛋白序列完全一致。RT-PCR 半定量分析表明：PcKAO1 基因在‘中矮1 号’各个检测的器官组织中均有表达,其中以种子和子房中的 表达量最高;在3 个品种的新梢叶片中,除新梢生长初期（5 月10 日）之外,其他时期矮化砧木‘中矮 1 号’均低于乔化和半矮化的对照品种‘早酥’和‘锦香’,而在这些时期‘中矮1 号’新梢生长逐渐减 缓乃至停长。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析

根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。     

柿果实内切–1,4–β–葡聚糖酶基因克隆与定量表达分析

 以成熟期‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）为材料,采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆柿果实中内切–1,4–β–葡聚糖酶基因（EG）cDNA,并在此基础上采用实时荧光PCR定量技术检测采后常温下柿果及GA₃、ABA和1-MCP处理柿果软化过程中该EG基因转录水平的表达特点。试验结果：获得了一个内切–1,4–β–葡聚糖酶基因cDNA,命名为DKEG1（GenBank accession number：HQ222561）,长2 011 bp,编码545个氨基酸,末端含有CBD区域。实时荧光PCR定量技术检测发现常温下对照组柿果采后3 d时出现DKEG1基因表达高峰,下降后又逐渐上升,并在12 d时出现第2个高峰;赤霉素明显抑制了柿果实在整个后熟过程中DKEG1基因的表达,尽管在6 d时也有升高,但与对照相比全程表达量均极低;ABA处理大大提高了DKEG1基因的表达量,没有出现采后3 d的表达高峰,但在6 ~ 18 d期间其表达量均高于对照的最高峰值,其表达高峰出现采后9 d;1-MCP处理的柿果表达高峰比对照推迟9 d,且前期表达量显著降低,但后期又上升。据此推断柿果实DKEG1的表达受乙烯生成和乙烯信号转导的调控,进而参与果实的后熟软化过程。     

库尔勒香梨kfpMYB及其启动子的克隆和对激素的应答反应

为明确库尔勒香梨萼片脱落和宿存与kfpMYB基因表达的关系,以其花器官为材料,根据库尔勒香梨kfpMYB基因cDNA序列及梨基因组信息设计引物,通过PCR获得了该基因长度为1 659 bp的基因组DNA序列和2 440 bp的上游调控序列,利用PLACE和PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析。生物信息学分析表明,kfpMYB启动子序列中存在一些与激素调节相关的元件,如脱落酸响应顺式作用元件ABRERATCAL、DPBFCOREDCDC3和EBOXBNNAPA,赤霉素信号抑制因子WRKY71OS、GARE-motif和TATC-box,生长素诱导有关元件NTBBF1ARROLB和TGA-element。利用实时荧光定量PCR检测了不同生长调节物质处理对kfpMYB转录水平的影响,实时荧光定量PCR分析结果表明ABA、ETH、GA、NAA和果树促控剂（PBO）对kfpMYB的表达均有不同程度的影响,说明这些调控元件参与了基因的表达。