巴西橡胶树乳管肌动蛋白细胞骨架与采胶的关系

以成龄巴西橡胶树为材料，用免疫印迹技术研究了胶乳中的肌动蛋白，并用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光探针检查了乳管伤口的肌动蛋白细胞骨架。割胶后收集的胶乳，经超速离心分离的各个组分中，C乳清(胞质溶液)组分含有肌动蛋白。排胶初始期流出的胶乳中肌动蛋白含量多，排胶后期流出的胶乳中肌动蛋白的含量减少。比较了不同割胶强度下收集的胶乳中肌动蛋白的含量，结果表明在强度割胶条件下，胶乳中的肌动蛋白含量较少。用显示肌动蛋白微丝的鬼笔环肽荧光探针检测到，停止排胶时的乳管伤口末端有一团呈现橙红色的荧光物质，表明了肌动蛋白微丝在伤口末端聚积。进行了外施肌动蛋白微丝的解聚剂大环内脂和碘化钾刺激采胶试验，结果表明：施用质量分数1％的碘化钾和饱和浓度的大环内酯水溶液能使胶乳产量增加。这些事实表明，肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管排胶和乳管堵塞中起重要作用。     

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。     

橡胶树肌动蛋白解聚因子原核表达及纯化

本研究根据HbADF序列设计引物扩增基因的编码区,并将其插入到原核表达载体pET28a上,成功构建重组质粒pET28a-HbADF。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经1 mmol/L IPTG诱导,获得相对分子量为20 ku的融合蛋白。表达蛋白以可溶和包涵体两种形式存在,通过亲和层析方法纯化可溶蛋白并获得HbADF融合蛋白,用抗HIS标签的单抗对纯化蛋白进行了Western blot鉴定。该结果为进一步研究HbADF蛋白特性及功能奠定基础。     

巴西橡胶树HbHDR的原核表达及HbHDR在乳管细胞中的亚细胞定位

4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸还原酶(4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR)是异戊烯基焦磷酸合成途径之一甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径中的最后一个酶,催化4-羟基-3-甲基-(2E)-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸.根据笔者从橡胶树中克隆的HDR基因(命名为HbHDR,GenBank登录号:EU881977)序列,构建了HbHDR的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达获得融合表达蛋白.将融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备HbHDR的高效价特异的多克隆抗体.Western-blot分析表明,HbHDR存在于乳管细胞的橡胶粒子和C-乳清中.     

巴西橡胶树HbCZF1的原核表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HMGR)是天然橡胶生物合成途径中的关键酶之一,在先前的研究中本课题组已克隆了与Hmgr1启动子互作的转录因子基因HbCZF1。本研究在此基础上,构建了HbCZF1的原核表达载体PET-28a(+)-HbCZF1,将其转化E.coli Rosetta(DE3)菌株。经优化条件后,在20℃,0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下,获得了分子量约47 ku的HbCZF1融合蛋白。     

巴西橡胶树乳管分化的研究

巴西橡胶树的乳管组织，是决定橡胶产量的是最重要的结构成份。人们一直从两个方面来研究乳管分化，即乳管分化的细胞学和植株内外固子对乳管分化的影响。我们认为，在这些研究中，最值得注意的结果，是采胶对乳管分化的影响。有证据表明，排胶促进乳管分化和原有全部成熟乳管的死亡或去除导致形成密集乳管。据此，我们假定在已有的成熟乳管中存在有抑制将来乳管分化的物质。我们相信，这一假定是深入研究这分化的一个可能的途径。     

巴西橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因（HbCP1）的原核表达分析

为研究巴西橡胶树半胱氨酸蛋白酶生物学功能,利用笔者从橡胶树中克隆的半胱氨酸蛋白酶基因(HbCPI)(GenBank登录号:DQ642886)序列,构建了HbCP1基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.结果表明,HbCP1基因在大肠杆菌中的表达产物具有生理毒性,抑制大肠杆菌的生长,初步确认RTX结构域是导致HbCPI表达产物具有生理毒性的原因.     

巴西橡胶树HbMADS4的克隆及原核表达分析

为了探讨巴西橡胶树自根幼态无性系高产的分子机制,通过抑制缩减杂交获得了在巴西橡胶树自根幼态无性系和老态无性系胶乳中差异表达的基因片段。为进一步鉴定差异表达基因的功能,对相关基因进行克隆。通过RACE方法克隆一个新的橡胶树MADS-box转录因子基因（命名为HbMADS4）, HbMADS4全长984 bp,含有633 bp的阅读框,编码230个氨基酸。推测HbMADS4蛋白分子量为23.71 ku,等电点为7.61,在N端含有典型的MADS-box结构域。构建HbMADS4原核表达载体pHbMADS4,将其转化E. coli, 经优化条件后,在20 ℃,0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下,获得HbMADS4融合蛋白。HbMADS4的克隆和HbMADS4融合蛋白的获得为深入研究HbMADS4的功能奠定基础。     

橡胶树乳管切割后的堵塞研究

用光学和电子显微镜技术研究了巴西橡胶树幼茎切割后乳管的堵塞。发现在切割后乳管伤口有一个由蛋白质物质组成的网，它与絮凝的橡胶粒子将乳管伤口堵塞。组成这个网的蛋白质物质主要来自黄色体的内含物，特别是微纤维。讨论了这种蛋白质网在乳管切割后堵塞中的作用。     

巴西橡胶树乳管伤口堵塞物形成调节的研究进展

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源,割胶是从橡胶树中获取天然橡胶的唯一途径。割胶后乳管伤口堵塞物的形成使排胶速度迅速降低,产量减少。对堵塞物的形成和调控的研究不仅具有重要的理论意义,也具有重要的应用价值。本文从堵塞物对排胶的影响、堵塞物的成分、堵塞物形成和调控的相关因素等方面进行了综述,为橡胶树排胶生理学的深入研究提供参考。     

巴西橡胶树AnnHb1基因的克隆及表达分析

根据一个从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码annexin的cDNA,命名为AnnHb1。序列分析表明,AnnHb1长为1 198 bp,含有945 bp的阅读框,62 bp的5'-UTR和191 bp的3'-UTR,编码314个氨基酸,分子量为35.99 ku,等电点为8.18。该氨基酸序列与蓖麻、麻疯树、棉花、苜蓿、烟草和拟南芥中的annexin的同源性分别为82%、72%、72%、64%、60%和60%。半定量RT-PCR分析结果表明AnnHb1基因在愈伤、花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在愈伤组织中表达量最低,树皮中表达量最高。     

巴西橡胶树ADF6基因的克隆与表达分析

肌动蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor,ADF)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白。ADF通过参与调控肌动蛋白的装配和解聚在多种生理过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶乳中获得HbADF6基因的cDNA和基因组序列,序列分析显示HbADF6基因的开放阅读框为441 bp,共编码146个氨基酸,基因组序列由2个内含子和3个外显子组成。实时荧光定量PCR结果表明,HbADF6基因在所有检测组织中均表达,其中树皮中表达量最高,叶片中表达量最低。HbADF6基因的表达受乙烯利(ET)和碘化钾(KI)调控,并与排胶时间和死皮有关。此结果表明HbADF6基因可能在橡胶树乙烯响应、死皮和排胶过程中发挥重要作用。      

橡胶树HbJAZ3突变体蛋白的原核表达及纯化

植物JAZ蛋白是茉莉酸信号调控途径的关键环节之一。HbJAZ3基因是橡胶树乳管细胞中编码JAZ蛋白的基因家族成员之一。本文采用原核表达和定点突变技术,构建了pET28a（+）-JAZ3、pET28a（+）-JAZ3-ZIM-mut（缺失ZIM结构域中TIFY基序）和pET28a（+）-JAZ3-Jas-mut（缺失Jas结构域的保守氨基酸FLEKRK）的His标签融合蛋白表达载体,并成功转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。在37 ℃条件下,用1 mmol/L IPTG诱导2 h能够诱导目的蛋白以包涵体的形式大量表达。通过镍柱纯化了目的蛋白,获得了HbJAZ3及其ZIM结构域和Jas结构域的突变体蛋白,为进步一鉴定乳管细胞茉莉酸信号途径的关键环节打下了良好基础。     

巴西橡胶树HbEBP1生物学特性、原核表达及氨肽酶活性分析

从巴西橡胶树中筛选到了Hb EBP1基因,该基因序列长度为1 462 bp,其中5′端非编码区长度为141 bp,3′端非编码区长度为133 bp,其c DNA序列具有完整的阅读框,编码395个氨基酸,推导的Hb EBP1分子量为43.596 ku,等电点位为6.45。生物信息学分析结果表明巴西橡胶树Hb EBP1具有3个保守结构域:增值相关蛋白2G4(PA2G4-like)、氨肽酶M24(APP_Met AP)、甲硫氨酸氨肽酶(MAP)结构域。对原核表达的Hb EBP1蛋白进行氨肽酶活性测定,发现体外表达的Hb EBP1蛋白没有Map活性。这些结果表明,橡胶树Hb EBP1基因并不存在氨肽酶活性。     

巴西橡胶树剥皮再生及乳管发生的研究

用光学显微镜技术研究了巴西橡胶树剥皮再生过程中的组织分化和乳管发生。研究结果表明：（１）巴西橡胶树茎干小面积剥皮后,新皮再生经过愈伤组织形成和维管形成层发生２个阶段。愈伤组织由靠近伤口表面未成熟的木薄壁组织细胞和木射线细胞分裂产生,维管形成层在愈伤组织内层发生,且是一个渐进的过程。（２）愈伤组织细胞不能分化形成乳管细胞,新生皮中最初形成的乳管组织从新形成的维管形成层细胞分裂产生,成列分布,并具有不     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC1     

茉莉酸在巴西橡胶树伤害防卫结构形成中的作用

研究了巴西橡胶树（Hevea brasiliensis)芽接树的萌条受机械伤害时外施茉莉酸（JA）对2种防卫结构创伤周皮和乳管的形成的影响。结果表明：（1）割伤幼茎树皮直至形成层或刮伤幼茎树皮去掉表皮和2-3层皮层细胞，都能在6d后看到诱导维管形成层分化出次生乳管。在伤口上施用JA或JA生物合成的前体亚麻醉（LA），能够使伤害诱导的乳管增加；而施JA生物合成的抑制剂indomethacin（IND）则产生抑制伤害诱导乳管分化的作用。（2）割伤或刮伤都能诱导形成创伤周皮，而在伤口施用JA和IND，JA可能不参与诱导创伤周皮的形成。（3）施用乙烯利和6-苄基腺嘌呤（BA）都不能引起创伤周皮形成，但BA能促进伤害诱导的创伤周皮细胞层数目增加。     

巴西橡胶树HbHEX1基因的克隆及表达分析

根据一个巴西橡树胶乳cDNA文库中的EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码homeobox蛋白的cDNA(命名为HbHEX1)。序列分析结果表明,HbHEX1长为1612bp,含有873bp的阅读框,292bp的5'-UTR和447bp的3'-UTR,编码290个氨基酸,分子量为33.02KD,等电点为6.35,含有保守的homomeodomain,属于HD-ZIP类。该氨基酸序列与蓖麻、马铃薯、胡萝卜的同源异型盒蛋白的同源性分别为92%、77%和72%。半定量RT-PCR分析结果表明HbHEX1基因在花和愈伤组织中基本上没有表达,在体细胞胚、芽、叶、胶乳和树皮中有表达,其中在胶乳中表达量最高。