纳豆激酶第36位氨基酸突变对其活性及热稳定性的影响

为了解纳豆激酶分子结构与其功能的关系,研究了纳豆菌诱变株DU115的纳豆激酶基因突变对其酶活性和热稳定性的影响。从原生质体紫外诱变纳豆菌DU115和野生纳豆菌BN10基因组DNA中扩增纳豆激酶成熟肽基因nkD和nkB,构建重组表达载体pPICZα-A—nkD和pPICZα-A—nkB,在毕赤酵母X33中实现了表达,并对表达产物进行分离纯化、酶活性测定及热稳定性检测。结果表明,与nkB基因序列相比,nkD基因有两处的核苷酸发生了突变（A107G和C396T）,A107G碱基突变导致氨基酸的替代D36G（Asp→Gly）;诱变菌株纳豆激酶DNK与野生菌的BNK在65℃处理15min后,前者的热稳定性提高20％,比活力提高16．6％。由此可推断,第36位氨基酸残基的突变可能与其酶热稳定性及活性提高密切相关。     

霉变饲用玉米真菌的分离、鉴定与乳酸菌素对其的防霉抑菌效果

为明确霉变饲用玉米中真菌的组成,探讨乳酸菌素对霉变真菌的抑菌效果和延缓饲用玉米霉变的作用.本研究采用传统真菌培养方法,对霉变饲用玉米中的霉变真菌进行分离,通过ITS扩增子测序确定霉变饲用玉米中可培养真菌的分类学地位;利用牛津杯法评估乳酸菌素对霉变真菌的抑制效果,并设置不同添加比例(10％、20％、30％)的乳酸菌素粗提...     

青贮饲料中乳酸菌的体外抑菌试验及其细菌素的提取

对10株乳酸菌进行了体外抑菌试验,发现乳酸菌对革兰阳性和革兰阴性指示菌均有明显的抑制作用。10株乳酸菌中X1、LM1、C15三株细菌的抑菌效果最好。选择X1、C15两株细菌进行细菌素的提取以及用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行初步鉴定,发现有明显的电泳条带。     

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。     

乳酸菌素对犊牛血液指标影响的研究

研究选用健康黑白花公犊牛32头,采用单因素随机实验设计,平均分为4组,每组8头,通过在犊牛日粮中添加不同水平乳酸菌素,研究其对犊牛血液指标的影响。结果表明乳酸菌素对血清中总蛋白、尿素氮和血糖的影响不显著;血清中甘油三酯的含量随日粮中乳酸菌素含量的增加而降低,其中T4组与T1组比较差异极显著(P0.01),降低了48.17%。乳酸菌素对IgG的影响较大;IgM的含量随乳酸菌素的增加而升高;IL-1和TNF-α的含量实验组与对照组比较差异不显著;IFN-γ的含量T2组与T1组没有显著差异,T3组与T1组比较差异显著(P0.05),T4组与T1组比较差异极显著(P0.01),达到203.13μg·mL-1。通过实验确定乳酸菌素在犊牛日粮中适宜的添加量为30~40 g,进而能增强犊牛机体免疫功能。     

乳酸菌产细菌素的研究进展及其应用前景

细菌素是细菌产生的一种有抑制作用的杀菌蛋白或多肽物质。大部分细菌素只对有近缘关系的细菌有抑制作用,具有无毒、无副作用、无残留、无抗药性,对环境无污染等优点。笔者阐述了乳酸菌产细菌素近20年来的研究进展,对乳酸菌细菌素在工业上的应用前景提出了展望。     

鸡β-防御素3(Gal-3)基因的克隆、表达及抑菌活性研究

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4h,诱导时菌体A600为0.6,蛋白表达量最高,且多数以可溶形式存在,33℃上清中的蛋白含量比37℃上清高。纯化的蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。【结论】成功克隆并表达了鸡Gal-3基因,其原核表达产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。     

猪瘟病毒Erns基因RNase酶活性位点的定点突变对其原核表达的影响

利用重组PCR技术将猪瘟病毒兔化弱毒株(Hog cholera virus lapinized Chinese strain,HCLV)Erns编码区30位His残基密码子CAT突变为Pro残基密码子CCC,将突变后的基因克隆至原核表达载体pET-28a( )中,构建成重组质粒pETmErns,并将此重组子转入宿主菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下表达重组转化菌.结果:突变的mErns基因能在pET表达系统成功表达.用Western blotting检测表明,所表达的蛋白是猪瘟病毒特异性的,但克隆于pET-28a( )中未突变的Erns基因却不能表达,说明Erns基因的RNA酶活性是影响该基因在Escherichia coli中表达的因素之一.     

猪瘟病毒E^ms基因RNase酶活性位点的定点突变对其原核表达的影响

利用重组PCR技术将猪瘟病毒兔化弱毒株（Hog cholera virus lapinized Chinese strain,HCLV）ETM编码区30位His残基密码子CAT突变为Pro残基密码子CCC,将突变后的基因克隆至原核表达载体pET-28a（＋）qb,构建成重组质粒pETmE^ms,并将此重组子转入宿主菌BL21（DE3）plysS中,在IPTG的诱导下表达重组转化菌．结果：突变的mE^ms基因能在pET表达系统成功表达．用Western blotting检测表明,所表达的蛋白是猪瘟病毒特异性的,但克隆于pET-28a（＋）d？未突变的E^ms基因却不能表达,说明E^ms基因的RNA酶活性是影响该基因在Escherichia coli中表达的因素之一．     

AcMNPV LEF-10第21位突变对其活性的影响

[目的]对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变,研究该位点突变对AcMNPV活性的影响,为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础.[方法]同源序列比对发现,LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守.对pTriEx质粒载体上LEF-...     

产细菌素乳酸菌对真空包装冷却羊肉保鲜效果的研究

从格瓦斯中分离得到3株具有抑菌性能的乳酸菌:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),将3株产细菌素乳酸菌作为生物保鲜剂应用在冷却羊肉的保鲜上。对冷却羊肉贮藏过程中的微生物指标、理化指标和感官评定等进行分析,结果表明:植物乳杆菌和戊糖乳杆菌能较好地抑制冷却羊肉中的腐败微生物,从而保证冷却羊肉的新鲜度和感官性状;而乳酸乳球菌则对冷却羊肉的保鲜效果不佳。     

定点突变对低温脂肪酶活性和热稳定性的影响

使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对粘质沙雷氏菌菌株L1的脂肪酶(lipA)每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行预测、筛选,用重叠延伸PCR法构建了2个脂肪酶突变体lipA-Asn86Glu、lipAAsn132Lys。经大肠杆菌表达和酶蛋白纯化后,对其酶学特性进行了表征。2个突变体和野生型的脂肪酶最适温度为30℃、最适pH值为8。与野生型相比,lipA-Asn86Glu的比酶活提高了8%,lipA-Asn132Lys的比酶活比野生型降低了19%;lipA-Asn86Glu在50℃下酶的半衰期与野生型相似,Km和Kcat值有所下降,而lipAAsn132Lys的50℃时半衰期、Km和Kcat都明显降低。上述结果为通过理性设计突变位点对酶进行分子改造,以提高酶活力或热稳定性,提供了借鉴和途径。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

新疆荷斯坦牛β防御素5基因的克隆、表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较37℃时多,且大多以包涵体形式存在,经纯化后最终获得了少量的目的蛋白。纯化的BNBD5蛋白对标准金黄色葡萄球菌和标准大肠埃希菌均具有明显的抑菌活性。【结论】克隆、表达了牛BNBD5基因,表达的BNBD5蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。     

抗菌肽Caseicin A氨基酸排列顺序改变对其抑菌活性的影响

Caseicin A是一种细菌发酵生产酪蛋白酸钠时产生的次级代谢产物,目前已有报道证明其对革兰氏阴性和阳性致病菌具有一定的抑菌活性.本试验通过对Caseicin A的氨基酸进行重排,得到了比原始抗菌肽抑菌活性更高的突变体.结果表明,改变抗菌肽氨基酸的排列顺序会引起其抗菌活性的变化,但对于不同的受试菌具有不同的影响.     

乳酸菌对老面团发酵过程中可溶性糖和游离氨基酸含量的影响

[目的]研究乳酸菌在老面发酵过程中对可溶性糖和游离氨基酸含量的影响.[方法]在5种乳酸菌与酵母菌在协同发酵老面过程中,采用高效液相色谱法测定老面中可溶性糖和游离氨基酸含量.[结果]乳酸菌在发酵初期会使得老面中的可溶性糖含量减少加快,但是发酵后期会使得其含量的增加,同时乳酸菌会增加发酵期间老面中游离氨基酸的含量;其中明登乳杆菌Z4对于可溶性糖的代谢促进最为明显,而旧金山乳杆菌S8可以促进麦芽糖的减少从而增加葡萄糖的含量,旧金山乳杆菌和短乳杆菌则对于游离氨基酸含量增加的促进较为明显.[结论]不同的乳酸菌对于老面中可溶性糖和游离氨基酸的代谢不同,最终会对馒头的品质产生影响.     

ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究(英文)

[目的]探讨ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素,优化表达条件。[方法]构建了ScMYB::pEASY-E1原核表达载体,研究了诱导剂IPTG浓度、诱导时间、温度及菌体浓度对该蛋白表达的影响。[结果]诱导剂IPTG浓度对表达量影响不大,而与诱导时间、温度及菌体浓度均有关。[结论]在37℃,诱导4h及OD600达0.6-1.0时,ScMYB原核蛋白诱导表达量最大。     

乳酸菌固态发酵对豆粕蛋白质含量、体外消化率及游离氨基酸含量的影响

试验利用固态发酵技术对豆粕进行发酵,结果表明,乳酸菌发酵酶解能够明显提高蛋白质体外消化率及游离氨基酸的含量。与未发酵相比,发酵48h时,蛋白质体外消化率提高6%,游离必需氨基酸含量提高24倍,游离总氨基酸含量提高45倍。     

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造,以期获得热稳定性强的突变子,提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测,以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体,经大肠杆菌表达和蛋白纯化后,对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH值和最适反应温度也未发生改变;R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍;在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2...