J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立

利用抗J亚群禽白血病病毒（ALV—J）囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV—J env抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。应用该方法检测SPF鸡血清、鸡抗禽流感H9亚型阳性血清、鸡沙门氏菌阳性血清、鸡腺病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清．结果均为阴性，无交叉反应；抗ALV—J阳性血清与ALV—J特异性单克隆抗体JE9能相互阻断；ALV—J阳性血清经酸处理后，ELISA检测的D490差值明显下降。对部分攻毒鸡血清样本及田间ALV—J阳性血清样本进行电镜观察，可见ALV—J样病毒粒子及ALV—J样免疫复合物。经与间接免疫荧光（IFA）检测ALV—J env抗体结果比较表明，建立的ELISA方法与IFA方法两者具有较好的群体符合率，群体符合率为8／9。这些结果表明，本研究建立的ELISA方法在ALV—J的诊断中具有很好的应用前景。     

祖代肉用鸡群禽白血病病毒感染的实验室诊断

对疑似J亚群禽白血病病毒（ALV－J）感染的祖代肉用型种鸡群进行病原微生物学的实验室诊断。组织病理学检测结果表明，病鸡脾、肾病理组织切片上有大量增生的髓细胞，呈典型的髓细胞瘤病理显微变化。肾组织触片和组织切片用抗ALV－J特异性单克隆抗体G2进行间接免疫荧光反应（IFA）检测，结果呈阳性。病料接种鸡胚成纤维细胞（CEF）盲传3代后，分离到1株病毒（JS－Nt），经鉴定为ALV－J。这些结果证明该鸡群存在ALV－J的感染。     

REV和ALV-J共感染鸡病毒血症及抗体反应的相互影响

为了研究禽网状内皮增生病痛毒（REV）、禽J亚群白血病病毒（ALV—J）共感染时对彼此病毒血症及抗体反应的影响，2日龄SPF鸡分别接种REV、ALV—J或同时2种病毒造成共感染，对各感染组7周内的病毒血症及抗体反应进行动态检测。相对于单一感染，共感染时，2种病毒的病毒血症水平动态均无明显变化。在单独感染ALV—J后5周有30％（5／16）的鸡产生抗体，而有REV共感染时，没有鸡产生针对ALV—J的抗体（o／16），表明REV感染可明显抑制鸡体对ALV—J抗体的反应，而REV与ALV—J共感染对REV抗体反应无明显影响。     

某蛋用型父母代鸡群种蛋中禽白血病病毒的检测

为了检测某蛋用型父母代鸡群是否存在外源性禽白血病病毒（ALV）的感染,收集该鸡群的92枚鸡胚,每枚鸡胚无菌取蛋清2份,一份用禽白血病病毒p27抗原检测试剂盒直接检测群特异性p27抗原,同时分别将92枚鸡胚蛋清接种DF1细胞,培养维持8d后取细胞上清检测p27抗原。将p27抗原阳性样品,分别用针对ALV-J和ALV-AB的单因子血清做间接免疫荧光检测（IFA）。比较p27阳性检出率。结果表明,直接检测蛋清的检出率高于蛋清接种DF1后的细胞上清,接种DF1细胞后p27抗原阳性样品的IFA检测结果显示ALV-J的阳性率为100%,ALV-AB全部为阴性。说明该蛋用型父母代鸡群存在的外源性ALV感染主要是ALV-J,该研究为针对ALV的净化提供了可行性检测方法。     

抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性

J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种主要感染肉用型鸡的反转录病毒。本研究用表达ALV-J囊膜蛋白基因产物的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞NS1进行融合，获得了4株特异性抗ALV-J的单克隆抗体。免疫荧光分析结果表明，3株单克隆抗体仅与所试验的ALV-J毒株反应，而不能与ALV的A、B、C、D和E亚群的毒株反应。有趣的是，有一株单克隆抗体可以与所有试验的外源性ALV毒株反应，但不与内源性的E亚群反应。Western Blot和免疫沉淀试验结果表明，单克隆抗体识别的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量为90-94kD，识别未糖基化的囊膜蛋白分子量约为53kD。用这些单克隆抗体能检测出ALV-J病毒感染鸡胚成纤维细胞中的病毒抗原。这些结果提示这些单克隆抗体可用于ALV-J疾病的诊断和流行病学调查。     

广西龙胜县某凤鸡养殖场禽白血病检测

为了解广西纯地方品种龙胜凤鸡中禽白血病（AL）的流行情况,采集龙胜凤鸡的肛拭子217份、蛋清样品59份和血清样品276份,采用禽白血病病毒（ALV）群特异性抗原p27和A/B、J亚群抗体检测试剂盒分别对肛拭子、蛋清样品和血清样品进行检测.结果显示,p27抗原的总阳性率为26.45％（68/276）;A/B亚群抗体的总阳性率为24.64％（10/276）;J亚群抗体的阳性率为3.62％（73/276）.结果表明,龙胜凤鸡的种群已存在ALV的感染,以A/B亚群感染为主.     

抗轮状病毒IgY的研制

用鸡卵黄制备抗轮病毒（RV）免疫球蛋白，预测和治疗婴幼儿RV感染，制备RV抗原，通过不同途径免疫母鸡，几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（IgY),进行原理化学检定及动物效力实验，结论：已成功地应用RV免疫母鸡制备出高效价特异性抗RV－IgV.     

进口海兰褐祖代鸡禽白血病感染状态的持续观察及与国内发病鸡群种蛋p27检出率、病毒分离率的相关性

对自国外直接进口的蛋用型海兰褐祖代鸡群的禽白血病感染状态进行了持续观察,并与国内3个不同发病状况的海兰褐父母代鸡群的种蛋p27检出率、抗体阳性率、投诉情况进行了比较.将国外直接进口的蛋用型海兰褐祖代鸡群3个配套系240只1日龄鸡在SPF环境中饲养,在不同日龄采集泄殖腔棉拭子检测禽白血病病毒(A-vian leukosis virus,ALV)群特异性p27抗原、采集血清检测ALV-AB及J特异性抗体和采集血浆分离外源性ALV,并在鸡群开产后收集种蛋,检测蛋清p27抗原和父母代鸡群胎粪p27抗原.同时对来自天津、山东的不同投诉情况的3个父母代鸡场种蛋p27抗原或ALV-AB及J抗体进行了检测.结果显示,进口祖代鸡ALV-AB及J特异性抗体在68、150日龄检测均为阴性；分别在12、26、68、150日龄采血浆在DF1细胞分离病毒均为阴性；收集的250枚种蛋蛋清和孵化的父母代鸡群胎粪p27抗原检测均为阴性.而其他国内3个父母代鸡场的种蛋p27检出率最高达12％.结果表明,该海兰褐祖代鸡群无外源性禽白血病的感染,不同鸡群的种蛋p27检出率与病毒分离率 及发病情况具有较好的吻合性,可以作为开展ALV的流行病学调查和种鸡场净化的重要指标.     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

蛋种鸡白血病净化研究

1净化意义禽白血病病毒(ALV)在自然条件下可通过饲料、饮水、孵化、输精、性别鉴定、污染粪便、疫苗及免疫接种等途径传播,带毒母鸡经蛋垂直传播给下一代。感染ALV的鸡其抗体产生动态规律是50日龄抗原阳性率开始上升,抗体阳性率低于10%。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗原阳性率远大于A亚型禽白血病病毒(ALV-A)。ALV-J感染可显著干扰抗体产生,ALV-A感染则抗体水平较高。ALV感染鸡后会出现抗原阳性率上升而抗体阳性率下降的现象。     

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB)基因，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶龟泳（SDS－PAGE）分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

马立克氏病病毒CV1988株pp24基因的克隆与表达

根据马立克氏病病毒（MDV）国际参考强毒CA株pp24基因序列，设计和合成了一对引物，其两端分别含SalI和EcoRI的酶切位点，以CV1988株基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其pp24基因。PCR产物经纯化后，按正确的阅读框架定向克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并用序列测定验证。将重组质粒转化的大肠杆菌BL21，在1.0mMIPTG和37℃条件下诱导，GST-pp24基因获得了表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和Westemblot试验验证。得到大小为43kD的融合蛋白，与预期大小一致。将该融合蛋白的凝胶带切下研碎后免疫小鼠三次后，其血清与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在间接免疫荧光试验中呈阳性反应。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to Marek's disease virus

A reproducible enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using Marek's disease virus (MDV)-infected cells for the detection of antibodies to MDV is described. The optimum number of MDV-infected chicken embryo fibroblasts (CEF) was 5 X 10(4)/well, and test sera were positive at 1:400 dilutions. Compared with a purified virus preparation, MDV-infected CEF produced high specific and low nonspecific reactivities. Wells coated with whole cells could be stored at 4 C or -20 C for at least 3 months without loss of reactivity. With antibody-negative sera, the cutoff absorbency was 0.20 units. The ELISA was 20-to-40-fold more sensitive than indirect immunofluorescence. Homologous combinations of antisera in wells coated with CEF infected with different MDV serotypes were more reactive at higher dilutions than were heterologous combinations. The procedure described is specific and suitable for large-scale screening of both chicken and monoclonal antibodies against MDV.     

商品代肉鸡J亚群禽白血病的病理及病毒分离鉴定

通过对山东某肉鸡养殖场发病的商品肉鸡组织病理学检查和将病料接种鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,我们在国内首次从商品代肉鸡中分离到了 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。从组织切片中可以看到肝脏、脾脏等器官的髓细胞瘤细胞 ,呈散在或成簇 ,髓细胞瘤细胞的细胞质内显现嗜酸性颗粒。用抗 AL V- J囊膜糖蛋白的单克隆抗体进行的 IFA中 ,病料接种 CEF后进行的 IFA呈现强阳性     

表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究

将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒（CS-FV）E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFVE2、PRRSVGP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5。经Western blot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较，无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。     

抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制及应用

以禽流感题H5和H9亚型病毒分别免疫Balh／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0的骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI）检测细胞培养上清，结果获得了6株特异性单克隆抗体，其中抗禽流感题亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株3株，分别命名为4B6、4A3、3H1；抗H9亚型病毒血凝素单克隆抗体细胞株3株，命名为6E6、6B6和5B4。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为2^13-15，细胞培养上清抗体HI效价为2^7-8。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与试验的相应题或ID亚型病毒株发生特异性反应，而不能与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综禽征病毒(EDS76)等反应。实验室检测结果证明，应用这些单克隆抗体能在24h内迅速检测出相应的禽流感病毒。所有这些单克隆抗体将在禽流感的预警预报工作中发挥重要作用。     

鸡白介素8的克隆表达及其生物趋化性研究

鸡白介素8(cIL8)是9E3/CEF4基因编码的一种诱导型趋化因子。用RT-PCR方法,从鸡胚胚体总RNA模板中扩增cIL8的cDNA序列,测序后,将cIL8基因分别克隆入pGEX-6p-1载体和pFastBacI载体进行表达。利用SDS电泳分离原核表达的cIL8融合蛋白,制备鼠抗cIL8血清,并与昆虫细胞表达的cIL8进行免疫荧光(IFA)反应,同时对雏鸡外周血单个核细胞(PBMC)进行生物趋化试验。结果成功扩增了cIL8基因的cDNA序列,在大肠杆菌和昆虫细胞中均能表达,制备的鼠抗cIL8血清能与昆虫细胞表达的cIL8反应。重组cIL8在一定浓度范围内,可使PBMC发生趋化作用,最高趋化指数为4.38±0.49,且是典型剂量依赖的钟形趋化性反应曲线。本研究结果为cIL8的功能研究和探讨马立克氏病病毒类白介素8(vIL8)的生物学作用奠定了基础。