产肠毒素性大肠杆菌F41与987P菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E．coliF41、987P基因序列,分别设计合成一对引物。利用PCR技术．分别以大肠杆菌C83707的基因组和C83710的质粒为模板扩增F41、987P基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含F41-987P串联表达载体的重组菌株BL21（DE3）／pETF41-987P。经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETF41-987P中含有F41-987P融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS．PAGE分析,串联表达蛋白含量在30％左右,经Western blot检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌F41、987P阳性血清识别。反向间接血凝试验结果,F41效价为2^6～2^8,987P效价为2^8～2^10。说明F41-987P融合蛋白具有良好的抗原性。表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。     

产肠毒素性大肠杆菌K88与K99菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coli K88、K99基因序列,分别设计合成1对引物.利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因.通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切,连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99).结果显示,经酶切,PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别.结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株.     

大肠肝菌K88、K99、987P、F41四粘附素联合苗的试用研究

本试验在海盐县的７个点对４１头具有连续黄痢病史的母猪在预产期前２１天左右应用大肠杆菌Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１四粘附素联合苗进行免疫，结果受试的７个点中的５个点共计２４胎３２２头仔猪无一例黄痢发生，平均黄痢发生率为５．１％，比前一胎下降５７．５％。相应的死亡率和病死率分别为０．７％和１３．８％，比前一胎分别下降２３．５％和２４．９％。     

猪源产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子研究进展

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要细菌性病原,初生幼畜感染后常因剧烈腹泻脱水而死亡。菌毛黏附素和肠毒素是ETEC目前研究最多的2类毒力因子,随着技术手段的不断进步和研究的深入,一些新型毒力因子不断被发现,如鞭毛、非菌毛黏附素、肠聚集性耐热毒素(the enteroaggregative heat-stable toxin1,EAST1)、自转运黏附蛋白、细胞溶血素等。本综述主要针对猪源ETEC的主要毒力因子以及新型毒力的结构功能及致病性进行阐述,为进一步深入探索ETEC的致病机理提供理论基础。     

一株不表达K88、K99、987P粘附因子的鸽源产毒素性大肠杆菌的分离鉴定

从病鸽尸体中分离出一株大肠杆菌,通过生化试验、血清学鉴定及动物致病性试验,表明该菌是一株具有很强致病力的不表达Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ粘附素的鸽源产毒素性大肠杆菌。     

大肠杆菌K88,K99,987P,F41四粘附素联合苗的试用研究

本试验在海盐县的７个点对４１头具有连续黄痢病史的母猪在预期前前２１天左右应用大肠杆菌Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１四粘附联合苗进行免疫，结果受试的７个点中的５个点共计２４胎３２２头仔猪无一例黄痢发生，平均黄痢发生率为５．１％，比前一胎下降５７．５％，相应的死亡率和病死率分别为０．７％和１３．８％，比前一胎分别下降２３．５％和２４．９％。     

K88、K99、987P仔猪大肠杆菌菌种的提纯和保存

由产肠毒素性大肠杆菌感染而引起的仔猪急性下痢分布十分广泛,本病主要危害一月龄以内的新生仔猪,尤其是一周龄以内的仔猪发病率和死亡率最高,多以急性、水样腹泻为特性。随着大型集约化养殖业的发展,病原性大肠杆菌对畜牧业所造成的损害已日益明显。产肠毒素性大肠杆菌含K88、     

猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。     

一株不表达K88,K99,987P粘附因子的鸽源产毒素性大肠杆菌？…

从病鸽尸体中分离出一株大肠杆菌,通过生化试验,血清学鉴定及动物致病性试验,表明该菌是一株具有很强致病力的不表达Ｋ８８,Ｋ９９,９８７Ｐ粘附素的鸽源产毒素性大肠杆菌。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

断奶和感染产肠毒素大肠杆菌对猪小肠吸收作用的…

本研究旨在测定断奶猪和未断奶同窝猪小肠对水分，钠，钾和氯的吸收以及确定这些值与小肠绒毛长度和隐窝深度的关系。８０头猪的小肠均分为５段，每段前端注射产肠毒素肠大杆菌（ＥＴＥＣ），后端注射对照液，在断奶时和断奶后，４、７、１１和１４天测定吸收作用。未断奶猪对液体，钾和氯的吸收不随时间而改变，而猪断奶后４、７和１４天对照肠段对水分的吸收明显减少，第４和７天牟氯的吸收低于未断奶对水分的吸收明显减少，第４和     

产肠毒素大肠杆菌F41感染猪小肠上皮细胞初期lncRNA的表达谱分析

本研究旨在分析产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,在感染初期细胞内长链非编码RNA （long non coding RNA,lncRNA）的表达谱变化,探究lncRNA在ETEC感染初期所起到的调控作用。使用ETEC F41感染IPEC-J2,在感染前和感染初期（感染后4 h）收集细胞,通过Illumina Hiseq Xten平台进行高通量测序,共发现lncRNA 9 975条。感染初期与感染前相比,共发现100条差异表达lncRNA,其中40条表达上调,60条表达下调。通过miRanda-3.3a和psRobot_v1.2软件共同预测差异表达lncRNA的靶基因,并对差异表达lncRNA的靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果显示,感染初期差异表达lncRNA的靶基因显著富集于细胞核、核仁、代谢过程调控及发育过程等GO功能条目中。KEGG分析表明,感染初期差异表达lncRNA的靶基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、黏附斑及细胞周期等信号通路。利用实时荧光定量PCR随机验证了5条差异表达lncRNA,结果与测序分析中表达变化趋势一致。本研究对ETEC感染IPEC-J2细胞初期的lncRNA表达谱进行了差异分析,为深入探究lncRNA在ETEC感染初期中的作用机制提供了参考依据。     

表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究

为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价.结果表明,免疫后小鼠特异性IgG、SIgA及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70％.结果表明rAd.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护.本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础.     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛抗原成熟肽的克隆表达及部分免疫学特性的分析

采用PCR方法,以83912(含K99)标准株菌液为模板扩增K99菌毛基因,克隆至pBS-T载体.提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定.经测序正确后,构建原核表达载体pET-28a-K99,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体蛋白经SDS-PAGE,在约18 Ku有一明显特异性条带,表达产物经初步纯化后,免疫印迹法(Western blotting)分析证实,此重组蛋白与K99阳性血清发生特异性反应.然后将初步纯化的重组蛋白免疫实验兔,并设对照组,建立间接ELISA法进行抗体检测,分析表达产物的抗原性和免疫原性,并对各组进行攻毒试验,为进一步对幼畜腹泻疫苗的研制奠定基础.     

K88-K99-987P-F41菌毛疫苗预防仔猪黄痢的效果

仔猪大肠杆菌性腹泻是养猪场最常见的疾病之一。而肠毒源性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病菌之一。其致病的前提是必须能在小肠黏膜定居、繁殖并产生肠毒素。ETEC表面能产生菌毛粘附因子使得这些菌株很容易吸附并定居于小肠黏     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETECK99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm—T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET—K99-ST1,将其转入表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导,获得31ku的蛋白;Western—blotting结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应。