细胞色素P450在家蚕中的研究

本文介绍了细胞色素P450及其发现、命名的研究史,概述了细胞色素P450的结构特征、分布的广泛和多样性及细胞色素P450主要功能。并从家蚕细胞色素P450的研究现状出发,基于家蚕作为鳞翅目昆虫代表——一种重要的模式生物的现实,简要地展望了以家蚕细胞色素P450研究为代表的家蚕功能基因组研究。     

添食氟化物对家蚕中肠组织细胞色素P450和b5含量的影响

为了探讨家蚕对NaF的代谢机制,以家蚕耐氟品种T6和敏感品种734为材料,5龄起蚕分别添食用200、400mg/LNaF溶液浸泡后的桑叶,检测蚕体内氧化酶系重要成员细胞色素P450和b5的含量变化。添食NaF后的168h内,耐氟品种T6中肠组织的细胞色素P450含量比添食清水对照组高3～7倍,细胞色素b5含量的增长与细胞色素P450含量的增长具有较高的相关性(R2=0.8220);添食不同浓度NaF溶液的差异不显著。添食NaF后的24～48h,敏感品种734中肠组织的细胞色素P450含量迅速增加,为添食清水对照组的1～2倍,随后逐渐下降,细胞色素b5含量的增长与细胞色素P450含量的增长无较好的线性关系(R2=0.4727);添食不同浓度NaF溶液的差异不显著。在氟化物作用下,耐氟品种T6中肠组织的细胞色素P450、b5含量显著增加,对氟化物敏感品种734中肠组织的细胞色素P450、b5含量变化相对较小,推测细胞色素P450和b5与家蚕对氟化物的代谢具有一定关联。     

家蚕细胞色素P450 CYP337A1的原核表达

以含有CYP337A1基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板进行PCR扩增,产物经TA克隆测序鉴定后,亚克隆至原核融合表达载体PET50（b）（含有编码64．3kD的Nus．Tag蛋白标签）中,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达。利用SDS-PAGE方法,以空载和未诱导菌体作对照,对细菌总蛋白进行电泳分析,结果表明：经1mmol／L IPTG诱导2h后,即能看到1条大约120kD的蛋白质特异带,与预计大小一致。进一步利用不同时间、不同温度以及不同浓度的IPTG进行诱导结果比较,发现在诱导时间为2h,温度为32℃,IPTG浓度为0．6mmol／L的诱导条件下,融合蛋白表达量最大。该实验为利用该基因的蛋白产物进行功能分析创造了条件。     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。     

家蚕细胞色素P450基因CYP9A22的克隆及在中肠和脂肪体的诱导转录

细胞色素P450对昆虫的生长发育、环境适应性以及抗药性具有重要作用。为了探讨氯氰菊酯对家蚕(Bombyxmori)细胞色素P450基因转录的诱导作用,采用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增(RACE)策略,从家蚕5龄幼虫克隆到细胞色素P450基因CYP9A22(GenBank登录号:EF535804)。CYP9A22基因的cDNA编码区长1 596 bp,编码531个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61 kD,等电点为7.71。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,有9个内含子;与已知的CYP9家族的棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP9A14基因的相应氨基酸同源性达到62.3%。用半定量RT-PCR方法分析氯氰菊酯诱导家蚕CYP9A22表达水平,结果表明:CYP9A22的mRNA转录表达具有组织特异性,在中肠的表达量高于脂肪体;氯氰菊酯诱导家蚕24 h,在其脂肪体的表达量是未诱导家蚕脂肪体的3.1倍,初步推测CYP9A22的过量表达可能与抗药性有一定关系。     

硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型的影响

本试验旨在研究硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型活性(含量)的影响及CYP3A37基因转录情况.选取180羽7日龄健康雏鸡,随机分为3组,分别为正常组、氟中毒组和加硒组.正常组饲喂全价日粮;氟中毒组在正常日粮中添加氟化钠(NaF),使日粮中氟含量为1 000 mg·kg-1;加硒组在氟中毒组日粮基础上添加亚硒酸钠(Na2SeO3),使日粮中硒含量为4 mg·kg-1.分别在第30、60、90天从各组随机选取20羽鸡,采用比色法测定P450酶系主要亚型活性(含量),利用RT-PCR方法测定CYP3A37 mRNA转录水平的变化.在添加氟化钠后第30天,氟中毒组除细胞色素P450含量和氨基比林-N-脱甲基酶(AND)活性低于正常组外,其余各酶活性(含量)较正常组均有增加(P<0.05);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和苯胺-4-羟化酶活性低于氟中毒组外,其余各哑型酶活性(含量)均高于氟中毒组(P<0.05).第60天时,氟中毒组酶活性(含量)均极显著高于正常组(P<0.01);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和氨基比林-N-脱甲基酶活性略高于氟中毒组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于氟中毒组(P<0.01).第90天时,氟中毒组除细胞色素P450含量略高于正常组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于正常组(P<0.01);加硒组中细胞色素P450含量和NADPH-细胞色素C还原酶活性略低于氟中毒组,其余各亚型酶活性(含量)均高于氟中毒组.在各时间点氟中毒组CYP3A37 mRNA转录水平均明显高于正常组(P<0.01);加硒组中mRNA转录水平介于氟中毒组和正常组之间.结果提示,饲料中添加氟化钠和亚硒酸钠可使鸡肝脏细胞色素P450酶系各亚型活性(含量)及CYP3A37 mRNA转录水平发生明显变化.     

微量菊酯类农药对家蚕细胞色素P450酶9家族基因转录水平的影响

昆虫细胞色素P450酶广泛分布于各种需氧生物,是一类参与机体代谢解毒或代谢活化作用的超家族酶系。分析家蚕细胞色素P450酶基因表达对微量菊酯类农药的响应,有助于从分子水平阐释家蚕对农药的生理代谢机制,以及探讨细胞色素P450酶活性与家蚕对农药耐受性的关系。以对菊酯类农药耐受性不同的2个家蚕品种为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测分析2个家蚕品种5龄第3天幼虫添食微量(0.02 mg/L)氰戊菊酯后主要解毒组织中肠和脂肪体中3个P450酶9家族基因的转录水平变化及在品种间存在的差异,结果表明:敏感性家蚕品种Lan5的幼虫脂肪体组织中CYP9a19和CYP9a20基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比显著下调,在中肠组织中2个基因的转录水平变化不大,而CYP9a22基因m RNA在中肠和脂肪体中的转录水平均无显著变化;耐受性家蚕品种Mysore的幼虫中肠组织中CYP9a19和CYP9a22基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比均显著上调,CYP9a20基因m RNA在脂肪体组织中的转录水平也显著上调。研究结果提示:细胞色素P450酶9家族基因的转录水平变化,可能与家蚕不同品种对菊酯类农药的耐受性差异有关。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6A8的克隆及序列与表达分析

昆虫细胞色素P450第6亚家族(CYP6)氧化酶在对异源有毒物质的代谢中具有重要作用。采用生物信息学方法获得与果蝇CYP6亚家族基因cyp6A8同源的家蚕cyp6A8基因序列,预测该基因的开放阅读框(ORF)为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白分子质量为61.52kD,等电点为8.17。以家蚕5龄第3天幼虫头部cDNA为模板,用设计的特异引物PCR扩增出一条约1500bp的条带,大小与家蚕cyp6A8基因的ORF预测值接近,命名为Bmcyp6A8基因(GenBank登录号:GQ241737)。同源性分析结果:Bmcyp6A8基因与野桑蚕cyp6AE8基因的相似性为93%;与棉铃虫cyp6AE12基因的相似性为57%;与人cyp3A43基因的相似性为48%。芯片数据分析显示Bmcyp6A8基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、表皮与中部丝腺前部高量表达,与家蚕CYP6亚家族的其它横向同源基因不同的是,只有该基因在中部丝腺前部表达,推测其具有功能特异性。     

细胞色素P450与兽药的研发应用

细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一种广泛存在于生物体内含亚铁血红素的超家族蛋白酶，由于其还原态与CO结合的复合物在波长450nm处有最大吸收峰，故名之。CYP决定着生物体内外源性化合物（如激素、药物、环境污染物等）的生物转化过程。研究CYP是新兽药研发、兽医临床合理用药的新课题，对兽药残留研究也具有重大的指导意义。     

家蚕氟化物中毒后血淋巴中脂质过氧化物和抗氧化物含量及抗氧化酶活性的变化

为了探究氟化物对家蚕的毒理作用,通过给家蚕5龄期幼虫添食NaF,检测氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中脂质过氧化物质丙二醛(MDA)、抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的含量变化以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等抗氧化物酶的活性变化。正常家蚕幼虫和氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中的MDA含量在5龄期均逐渐下降,但氟化物中毒家蚕的MDA平均浓度比正常家蚕升高了83.77%;GSH含量变化趋势为5龄第1天和第5天较高,第3天较低,但氟化物中毒家蚕5龄期的GSH浓度平均比正常家蚕下降了47.81%;氟化物中毒家蚕5龄期的GSH-Px和GST的平均活性分别比正常家蚕升高63.49%、39.22%,5龄第3天达到最高峰,5龄第1天和第5天较弱。初步分析认为家蚕幼虫血淋巴中MDA和GSH的含量变化以及GSH-Px和GST的活性变化,与家蚕氟化物中毒后体内氧自由基含量上升和脂质过氧化作用增强密切相关,可作为诊断家蚕氟化物中毒的生化指标。     

氟化物对不同抗性家蚕品种的GST和AChE酶活性影响及雌雄个体间的酶活性差异

为了探明家蚕的耐氟性机制以及耐氟性在不同性别蚕体间的差异,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,自5龄起蚕开始分雌雄喂食清水和200 mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,检测幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。添食氟化物后耐氟和敏感家蚕品种5龄幼虫中肠的GST活力随添氟时间的变化趋势与对照组比较一致,且与对照组相比酶活性均呈增高趋势;敏感品种734添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.486倍,耐氟品种T6添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.529倍。敏感品种734对照组5龄幼虫在试验第3天头部的AChE酶活性显著升高,但添氟组雄蚕在试验第2天AChE酶活性即显著升高,而雌蚕的AChE酶活性在整个5龄试验期均呈平缓下降趋势;耐氟品种T6添氟组5龄雌、雄幼虫的AChE活力与对照组差异不大,酶活力随添氟时间的变化趋势也与对照组较为一致,均在第3天出现最低值;2个品种添氟组AChE酶活性的性别差异与GST相反,即雄蚕的AChE平均活力大于雌蚕。推测氟化物处理后耐氟家蚕品种仍然能够保持AChE酶活性水平,从而呈现对氟化物的耐受性;2种类型解毒酶活力在雌雄家蚕间的差异可能暗示同一品种雄蚕的耐氟能力较多涉及靶标抗性,而雌蚕的耐氟能力较多依赖于代谢抗性。     

家蚕中肠酸性磷酸酶细胞化学的研究

应用超微结构酶细胞化学技术研究了家蚕幼虫中肠ＡＣＰａｓｅ 活性的亚细胞分布,结果表明ＡＣＰａｓｅ 主要分布在圆筒形细胞的细胞核内,核周围的内质网及溶酶体中,杯形细胞的细胞核、细胞底部的内褶膜上也有少量的酶活性存在。不同数量性状的蚕品种间圆筒形细胞细胞核内的ＡＣＰａｓｅ 活性分布有显著差异。     

家蚕中肠组织蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的中肠组织进行了研究,利用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,并采用GPMAW软件对家蚕基因组预测的蛋白质数据库进行了本地构库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。结果发现,家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和图像分析,银染后可以检测出600个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量15～80 kD区域,等电点3～8.5之间。MALD I-TOF MS鉴定的36个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中32个蛋白点得到了成功鉴定,包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等。这一结果为进一步认识家蚕中肠组织的生理功能提供了基础信息。     

家蚕5龄幼虫体内共轭酶和二氢叶酸还原酶的基本性质

共轭酶 (EC 3 4 2 2 12 )和二氢叶酸还原酶 (EC 1 5 1 3)是生物体内重要的叶酸代谢酶。以家蚕幼虫为材料分析了这两种酶的基本性质。 5龄幼虫体液共轭酶反应的最适pH为 7 8,最适温度为 5 0℃ ;反应体系中添加巯基乙醇、K+ 或Mg2 + 可显著提高酶活性 ,而对羟高汞苯磺酸、Co2 + 、Zn2 + 、Fe2 + 等对酶活性具有明显的抑制作用 ;以叶酸五谷氨酸为基质的水解产物为叶酸 ;另以叶酸三谷氨酸为底物 ,采用 33mmol/LHepse Ches缓冲液 (pH 7 8)在 37℃的反应条件下 ,求得Km 为 9 6 μmol/L。幼虫脂肪体等组织中二氢叶酸还原酶以NADPH为供氢体 ;在pH 4 5～7 5的范围内具有较强活性 ,最适反应温度 35℃ ;巯基乙醇、胍 ,以及高浓度的 1价金属离子 (K+ 、Na+ 等 )对酶具有活性化作用 ,对氯高汞苯甲酸、甲酰胺、Co2 + 等具有强烈的抑制作用 ;采用 35mmol/L柠檬酸 磷酸钠缓冲液 (pH 5 .0 ,10g/L抗坏血酸 )在 30℃的反应条件下 ,求得Km 值为 2 7μmol/L。家蚕体液可作为共轭酶的新酶源而加以利用。     

氟化物对家蚕生长发育的影响

为了探究家蚕T6和734两品系耐氟力的差异,分别对其4龄时期氟敏指数,以及5龄时期体重变化和死亡率进行调查,在100ppm、200ppm、300ppm、400ppm氟化物浓度下．734的氟敏指数分别是：29．14、62．22、104．36和137．61,而T6的分别是：4．38、11．13、26．87和43．76,两品系的氟敏指数随着氟化物浓度的增大而增大,但734指数增加远远大于T6;734体重变化较T6明显。并且734的死亡率也远大于T6。表明了家蚕T6品系具有较强的耐氟能力。