杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。     

几个杨树木质部特异启动子的分离与序列分析

为了获得能在桑天牛(Apriona germari)寄主树种木质部特异表达的启动子用于害虫的防治,参照美洲山杨(Populus tremuloidMichx.)木质部纤维素合酶基因(PtCesA)序列(GenBank登录号:AF072131)设计引物,分别以三倍体毛白杨-93(Populus tomentosaCarr.-"93")、加杨-1(Populus CanadensisMoench.-"1")、意大利214杨(Populuscanadensiscv."I-214")基因组DNA为模板进行体外扩增,分离得到了MDCesAP、MXCesAP、JCesAP、YCesAP共4个片段。虽然4个片段序列之间及与美洲山杨中分离到的PtCesAP基因的同源性较低,但4个片断序列中的A/T含量都在60%~75%之间,且都有TATA box、poly(A)等启动子调控元件,因而有可能是新发现的特异启动子。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

启动子Actinl的克隆及植物表达载体的构建

通过提取水稻叶片基因组DNA，设计PCR扩增特异引物，克隆单子叶特异表达启动子Actinl基因，与T载体连接，转化E．coliDH5α，得到重组子，经酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1238bp，通过序列对比分析发现与已发表的Actinl碱基序列有99．60％的同源性。特异启动子基因驱动的抗真菌肽(AFP)基因植物表达载体，就可以进行早熟禾黑麦草等单子叶牧草的遗传转化，为单子叶牧草和草坪草的抗真菌病研究提供方法。     

基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体

基于四环素调控系统构建白蛋白(albumin,Alb)启动子调控大鼠uPA(urokinase-type plasminogen activator,ruPA)转基因肝特异性过表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG)。以CTG0875-2-11质粒为模板,PCR扩增大鼠的uPA(ruPA)基因,3’端添加Flag标签,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)质粒中,得到慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG),所构建质粒经测序和酶切鉴定。将pLATTRUTG瞬时转染293T细胞,转染后24 h倒置荧光显微镜检测CopGFP表达;接着向6孔细胞培养板内加入强力霉素(Doxycycline,Dox),48 h后在倒置荧光显微镜下观察CopGFP表达(包括未加Dox的孔),随后收集细胞以提取总RNA和总蛋白,用于RT-qPCR检测ruPA及报告基因表达和Western blot检测标签蛋白Flag表达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载体pLATTRUTG;瞬转293T细胞后,24 h倒置荧光显微镜下可见零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光,加Dox 48 h后所有细胞展现强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然只见到零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与不加Dox的细胞相比,加Dox的细胞中ruPA、报告基因CopGFP和Flag表达水平显著升高。结果提示,成功基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体pLATTRUTG,为相关后续实验奠定了基础。     

棉纤维特异启动子LTP12驱动的基因phaB、phaC双价载体构建

聚羟基丁酸酯(PHB)具有抗皱、保暖等特性,若棉纤维中存在PHB则棉纤维保暖性和抗皱性将会提高,因此通过基因工程技术手段将聚羟基丁酸酯的合成酶基因导入棉花中,就有可能在棉纤维发育过程中合成PHB,提高棉纤维的抗皱性、保暖性和防水等特性,从而达到改良棉纤维的品质。本研究分离了棉纤维特异启动子LTP12和聚羟基丁酸酯合成酶基因phaB和phaC,并构建了由LTP12驱动的基因phaB和phaC的双价植物表达载体pBLTPPBPC。     

棉纤维特异启动子LTP12驱动的基因phaB、phaC双价载体构建

 聚羟基丁酸酯（ＰＨＢ）具有抗皱、保暖等特性,若棉纤维中存在ＰＨＢ则棉纤维保暖性和抗皱性将会提高,因此通过基因工程技术手段将聚羟基丁酸酯的合成酶基因导入棉花中,就有可能在棉纤维发育过程中合成ＰＨＢ,提高棉纤维的抗皱性、保暖性和防水等特性,从而达到改良棉纤维的品质。本研究分离了棉纤维特异启动子ＬＴＰ１２和聚羟基丁酸酯合成酶基因狆犺犪犅和狆犺犪犆,并构建了由ＬＴＰ１２ 驱动的基因狆犺犪犅和狆犺犪犆的双价植物表达载体ｐＢＬＴＰＰＢＰＣ。     

表达绿色荧光蛋白的鸭肠炎病毒gE基因转移载体构建

本实验利用PCR方法扩增DEVC-KCE株gE基因片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRI、SalI位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHI位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。该转移载体有7个单一酶切位点可供外源基因插入,上下游侧翼分别为1.57Kb和1Kb。将转移载体pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。     

表达绿色荧光蛋白为伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株gG全基因，PK，gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，肖除其中的EcoRI位点，将通过PCR扩增的增强绿色 荧光蛋白基因（EGFP）融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG^-1/EGFP^ ，该转移载体单独转染或同PVR基因组DNA共转梁IBRS－2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达，共转梁时，6h就可在荧光显微镜下观测到明显的荧光。     

绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础.     

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中.     

不同截短的丝素重链基因启动子驱动报告基因在家蚕组织中的表达

应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,研究不同截短的丝素重链基因启动子(-2127/+23、-925/+23和-238/+23)驱动报告基因在家蚕5龄幼虫组织中的表达情况。结果发现,通过病毒感染介导,3种长度丝素重链基因启动子驱动的报告基因在脂肪体和血细胞中存在异位表达,从个体体表可直接观察到明显的绿色荧光;3种长度的启动子都能在后部丝腺中高效起始EGFP的转录,产生绿色荧光;长度为0.9kb和0.2kb的启动子0.9KH、0.2KH在中部丝腺能起始EGFP转录产生绿色荧光,而2.1kb的启动子(2.1KH)能起始EGFP转录,但未能检测到绿色荧光;3种长度的启动子也能在Sf9培养细胞中起始EGFP基因表达。上述结果表明,丝素重链基因启动子没有严格的组织特异性。     

利用重叠延伸PCR构建红色荧光蛋白布鲁氏菌表达载体

为了构建能够在布鲁氏杆菌宿主细胞和宿主个体中稳定表达红色荧光蛋白的载体,试验通过PCR分别获得核糖体结合位点-红色荧光蛋白（RBS-Red）与布鲁氏菌特异DNA（BDNA）片段,利用重叠延伸PCR获得RBS-Red-BDNA重叠片段;将重叠片段插入pLB载体,利用Sma Ⅰ与Sac Ⅱ对重组pLB载体和pMC-221质粒进行双酶切后连接目的片段,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;提取的质粒电转布鲁氏菌16M菌株感受态细胞,将电转后的16M-pMC-Red菌株涂布于含有氯霉素抗性的布鲁氏菌培养基,倒置荧光显微镜下观察菌株颜色;16M-pMC-Red菌株侵染小鼠巨噬细胞,制成细胞爬片,激光共聚焦荧光显微镜下观察小鼠巨噬细胞,鉴定红色荧光蛋白表达情况。结果显示,利用重叠延伸PCR技术成功改造了红色荧光蛋白布鲁氏菌双启动子表达载体;将改造获得的质粒电转进布鲁氏杆菌16M菌株,菌株荧光鉴定能够稳定表达红色荧光蛋白;电转成功的16M-pMC-Red菌株侵染小鼠巨噬细胞后,可以稳定表达红色荧光蛋白。试验构建的发红光质粒pMC-Red可以与发绿光质粒pMC-221联用,为不同种株布鲁氏菌之间的联合研究奠定了基础,也为布鲁氏菌病检测提供了一个以荧光检测为指标的新策略。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化

根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的两对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建含有发夹结构的RNAi载体pART-S-A.利用农杆菌介导方法,将pART-S-A转化到紫花苜蓿中,经PCR检测,获得了7株转基因植株.经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因表达量有所下降,其中5株的表达量明显的降低.结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-S-A,它可有效的抑制紫花苜蓿MsCOL1基因.     

类蚕丝丝素结晶区蛋白表达载体的构建与表达

为探讨蚕丝结构与性能的关系,设计了几种类似蚕丝丝素结晶区高度重复序列结构(GAGAGX)n的基因序列,并构建了大肠杆菌表达载体,在BL-21菌株中成功诱导表达了4种约由110个氨基酸组成的小分子蛋白。对表达产物进行W estern印迹分析和ELISA检测的结果显示,(GAGAGA)n、(GAGAGY)n、(GAGAGV)n3种蛋白都有小于14.4 kD的大小相同的条带,而(GAGAGS)n有一条稍大于20.1 kD的条带。以超声波破菌的缓冲液作空白对照,4种蛋白的ELISA的结果均比对照的BL-21(无质粒)高,显示为阳性。