桑树黄化型萎缩病的综合防治

<正> 桑树黄化型萎缩病是一种全株性的传染病害,安徽省各蚕区都有不同程度的发生,休宁县是该病危害严重的地区。为了控制该病的蔓延,在安徽省农林厅和有关部门的帮助下,休宁县建立了桑树萎缩病综合防治研究小组,选点徽光乡、休宁县蚕桑场为综合防治区,渭桥乡叶村为无病育苗基地。从1985—1987年采取了一系列的综合防治措施进行试验,取得一定成效,现报道如下。     

桑树黄化型萎缩病发生原因及防治方法

三烈乡近年来桑树黄化型萎缩病的发生越来越严重,对蚕农造成了很大的经济损失,本文探讨了桑树黄化型萎缩病发生的原因和防治对策,以期在蚕桑生产中起到减少损失的作用。     

桑树黄化型萎缩病的识别与综合防治

桑树黄化型萎缩病是危害桑树最严重的一种病害。河南省重点蚕区都有不同程度发生，其危害情况表现为：受害严重的桑园株发病率在60%左右，高达90%；新植桑园年损失桑株4%左右；严重受害桑园在植桑后十年中与正常桑园比经济损失达80%，与正常农作物比经济损失40%，桑园生产年限缩短10年左右。这种病害对蚕桑生产的稳定持续发展，威协性很大，已引起国家农业部重视，决定在我国重点蚕区对该病实行联防联治。 　　1　黄化型萎缩病的识别 　　1.1　桑黄化型萎缩病的识别。桑树黄化型萎缩病在桑树生长期间，症状表现比较典型，在不同发病阶段，发病程度也有很大差别，所以病株一旦在田间出现，容易识别。该病的发生及症状表现，一般可分为三个时期： 　　发病初期：一般从一根或2～3根枝条的顶端开始，表现出节间距离特短，叶片黄化、瘦小并稍向叶背卷缩；从整根枝条看，病、健叶大小十分悬殊，病小叶在健叶上方形成菊花状丛生。此期一般在5月中旬和8月下旬。 　　发病中期：随着病情发展，多数枝条乃至全株枝条表现症状，病势从枝条上部开始逐渐向下部蔓延，病叶更加黄化瘦小，明显向叶背卷缩，枝条中上部节间变短，腋芽早发，生长出较多的细小侧枝，但枝条中下部节间，叶片生长正常。此期症状一般在7～8月份表现集中。 　　发病后期：整株叶片黄化更甚，卷缩成猫耳朵状，靶条细弱，腋芽不断萌发，造成整株桑细枝丛生成簇，宛如扫帚状，2～3年内终致枯死。此期病状，在桑树夏伐后，表现突出，重病桑园尤为严重。     

诊断桑树黄化型萎缩病的新方法

本文探讨利用瑞氏染色法和旦尼氏染色法诊断桑树黄化型萎缩病的可能性。试验结果表明,用此方法,在病株枝条或主根的横切面上,韧皮部的病原寄生部位被染成兰色或青色,呈阳性反应,健株组织切片的韧皮部则不着色,呈阴性反应。可作为桑黄化型萎缩病病株的实验诊断手段。     

桑树萎缩病的研究进展

对桑树萎缩病的病原、病原物的分类、病原物的致病性及其传播媒介、病害流行的影响因素、病害的诊断与防治进行了综合论述,并对当前桑树萎缩病研究存在的问题进行了简要分析。     

黄化型萎缩病对桑树光合特性的影响

由植原体寄生所引起的桑树黄化型萎缩病是蚕桑生产中的一种毁灭性传染病。研究了桑树感染黄化型萎缩病后的光合特性变化:被感染桑树的叶绿素含量、叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、羧化效率与健康对照相比出现了不同程度的下降,胞间CO2浓度也有所下降,但叶片中的淀粉含量呈上升趋势。根据以上结果认为:植原体侵染桑树导致叶片光合能力明显下降,光合作用受到明显抑制。     

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

桑树黄化型萎缩病流行原因及防治对策

桑黄化型萎缩病俗称"癃病",是由一种类菌原体引起的全株性病害.发病初期桑树顶端叶片缩小变薄,叶色黄化,腋芽早发;发病后期叶片更加瘦小,侧枝丛生,形如扫帚.一般2～3年整株枯死,严重影响桑叶产量和质量,给蚕桑业带来毁灭性灾害.目前,宿豫区桑园桑黄化型萎缩病为害相当严重,全区3000hm2桑园发病面积近670hm2,一般株发病率在5%～20%,其中株发病率在30%以上的重病桑园有200hm2左右,个别田块经过多年累积,株枯死率达40%以上,严重阻碍蚕桑业效益提高,影响整个行业稳定和发展.     

桑树苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC 4.3.1.5)是植物体内苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶,与植物的抗病性和植物体内黄酮类色素等多种次生物质的生物合成密切相关。利用同源克隆方法成功克隆了桑树苯丙氨酸解氨酶基因(pal)cDNA片段(GenBank登录号:FJ938356),该片段长1 105 bp,编码367个氨基酸,氨基酸序列的34-50区域为PAL的特征序列。桑树pal基因和其他植物pal基因的同源性分析表明其与甜樱桃的亲缘关系最近,同源性高达82%,与树莓的同源性达80%,与杨树和咖啡树也达到75%,由此也证实克隆的桑树cDNA片段为pal基因家族成员之一。     

桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析

桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。     

桑树1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶基因cDNA片段的克隆及原核表达与植物反义表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(RCA)对桑树的光合作用具有重要调节作用。以桑树幼叶为材料分离mRNA,反转录合成cDNA,以cDNA第1链为模板,根据RCA的保守区域设计1对兼并引物,经PCR扩增获得RCA的基因功能区中间片段。对得到的桑树RCA的cDNA片段编码氨基酸进行BLAST分析表明,其与GenBank中其它植物来源的RCA有较高同源性。将RCA的部分编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导,RCA的部分编码区在BL21菌株成功表达。将得到的RCA基因片段反向插入植物表达载体,构建了RCA基因反义表达载体pBI121-RCA,以利于进一步阐明RCA与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶相互作用和调控关系以及用基因工程手段深入探讨桑树光合作用机制。     

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。     

桑树Ca~(2+)/H~+反向转运体基因MCAX-1的克隆及序列与表达分析

植物体内的Ca2+/H+反向转运体在Ca2+介导的营养和信号转导中发挥着重要作用。选择桑树幼叶cDNA文库中功能注释为Ca2+/H+反向转运体基因(CAX)的一条EST序列设计引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)与反转录PCR(RT-PCR)在桑品种育71-1的幼叶中克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为MCAX-1(GenBank登录号:JN716318)。序列分析显示:MCAX-1全长1 784 bp,包括197 bp的5'端非翻译序列和243 bp的3'端非翻译序列,含有一个1 344 bp的完整ORF,编码447个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为47.93 kD,等电点为5.67。构建的桑树和其它植物基于CAX蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树与盐地碱蓬(Suaeda salsa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)等有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑树幼芽、嫩叶、根和幼花中的表达量较高,在韧皮部、木质部和成熟果实中的表达量较低;MCAX-1在低温胁迫下的表达量减少,-1℃时几乎无表达,在干旱胁迫下的表达量随着胁迫时间延长逐渐达到最大值之后又迅速降低,在盐分胁迫初期的表达量无变化,但胁迫18 d时表达量明显降低。初步推测MCAX-1与桑树的抗逆性能有一定关联。     

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

桑树多聚泛素基因的克隆及序列分析

将蒙古桑于-3℃诱导48 h后,提取幼茎RNA反转录合成cDNA(第一链),以cDNA为模板,利用RT-PCR技术克隆桑树的泛素基因(mUb)。研究结果表明:克隆片段序列为泛素基因的阅读框架,其中有2个起始密码子(ATG)和1个终止密码子(TAA),长度为459个碱基;序列与菠萝、三叶胶树、烟草等物种的泛素基因相比较,有84%以上的同源性。进一步分析表明,该基因是桑树的二串泛素基因。该基因已被GenBank收录(登录号DQ104334)。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。