柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在鸡胚培养和鸡肾细胞中的发育

采用体外脱囊的方法,将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和堆型艾美耳球虫(E.aceroulina)的子孢子分别接种于9日龄 SPF 鸡胚的尿囊腔和鸡肾原代细胞中,置40～41℃恒温箱中培养.E.tenella 子孢子接种 SPF 鸡胚尿囊腔后,24h 后发现早期的第一代裂殖体;34h 后可观察到成熟的第一代裂殖体和裂殖     

巨型艾美耳球虫裂殖子的分离和纯化

[目的]为了获得纯净的巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)裂殖子.[方法]对25日龄白羽肉鸡口服接种 3×105巨型艾美耳球虫卵囊,在其感染后48～124 h取十二指肠末端到卵黄蒂后5 cm处肠段,收集裂殖子并计数,确定分离裂殖子的最佳时间;将所取肠段均分为5段,分别对裂殖子进行计数,筛选分离裂殖子的最佳肠段;通过DEAE-52纤维素柱层析对裂殖子进行纯化并分管收集,确定收集较高纯度裂殖子的最佳时间.[结果]在感染后84 h所收集的裂殖子最多;此外,从空肠中后段及空肠末端肠段中分离出较多数量的裂殖子,占总数的62％以上;通过DEAE-52纤维素柱层析获得44 mL纯度较高的裂殖子.[结论]分离巨型艾美耳球虫裂殖子的最佳时间为感染后84 h,最佳肠段为空肠后段,收集1～44 mL洗脱液能够获得纯度较高的裂殖子.     

柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体纯化方法的改进

本文报道了改进的柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体纯化方法。用胃蛋白酶消化盲肠道组织，铜筛过滤除去大颗粒杂质后，以1．1mol·mL－1蔗糖离心漂浮卵囊，然后用小于0．5mol·mL－1蔗糖溶液反复漂洗，最后以5％次氯酸钠消毒处理，获得了大量纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊。孢子化卵囊经研磨，消化，游离出子孢子后，过DEAE-纤维素52层析柱，以0．05mol·mL-1，Tris－HCl，（pH＝80，0．15mol·mL1-NaCl）洗脱，层析往高5cm，洗脱液水柱高3cm，流速为2mL·min－1，纯化出了子孢子。取人工感染球虫鸡的120h后的盲肠，游离出第二代裂殖子，铜筛过滤后，过柱方法同前，纯化出了第二代裂殖子。结果证明本法分离的子孢子和第二代裂殖子活性好，回收率达87％。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞中的发育研究

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞体外培养中完成了全部的内生性发育过程     

巨型艾美耳球虫Eimeria maxima内生发育阶段的细胞化学研究…

本试验利用组织化学技术对巨型艾美耳球虫内生发育阶段细胞内的多糖，核酸，碱性核蛋白进行的研究证明，裂殖体，大配子，小配子体，卵囊内都存在ＤＮＡ，ＲＮＡ和碱性核蛋白。滋养体，多核体和小配子体内未检内未检同多糖。裂殖体，大配子和合子含有多糖，成熟的大配子和合子多糖含量丰富。结果表明，多糖是由球虫自身合成并在其发育过程中消耗。     

布氏、巨型和堆型艾美耳球虫在鸡体内发育特性的研究

利用肠粘膜压片镜检的方法,对 E.brunetti,E.maxima 和 E.acervulina 在鸡体内的发育部位和各期虫体的形态学特性进行了研究,经三次重复试验检查结果表明,E.brunetti 第一代、第二代裂殖生殖主要在空肠和回肠进行;第三代裂殖生殖,配子生殖和卵囊形成主要在空肠、回肠、直肠和盲肠近端进行;第三代裂殖生殖,配子生殖和卵囊形成主要在空肠、回肠、直肠和盲肠近端进行.朋代裂殖体出现时间分别为接种后24～48h;56～80h 和88～96h;小配子体与大配子体均于104～112h 出现,未完全成熟的卵囊和极少数成熟卵囊见于112～120h。     

细胞凋亡对柔嫩艾美耳球虫入侵的影响

为了研究球虫与宿主细胞间相互关系,利用含有6%乙醇的DMEM完全培养基培养对MDBK细胞进行凋亡诱导,通过膜联蛋白V(Annexin V)/PI染色法、HE染色法和吖啶橙染色法来鉴定MDBK细胞的凋亡情况。蔗糖密度梯度离心法获得的柔嫩艾美耳球虫子孢子与诱导凋亡的细胞共培养1 h后,利用HE和吖啶橙染色法来研究子孢子入侵细胞的状况。结果显示,在诱导凋亡的细胞中,没有发现柔嫩艾美耳球虫的子孢子,对照组未诱导凋亡的细胞中有子孢子入侵。表明球虫无法入侵诱导凋亡的细胞,进一步揭示了球虫在入侵过程中可能存在的识别机制和入侵机制,为将来开发新疫苗和新药物提供了基础数据。     

巨型艾美耳球虫感染鸡空肠粘膜肥大细胞数量和组织胺含量的变化

通过用地塞米松处理鸡和用特异性抗原作刺激因子的微量全血淋巴细胞转化试验(LPA),研究了雏鸡抗 Eimeria maxima 再感染中细胞免疫现象。结果表明,地塞米松处理可损伤鸡抗 E.maxima 再感染的免疫力.这提示了 CD8+T 细胞、γIFN 及 IL-2等在抗 E.maxima 卵囊抗原刺激因子的微量全血 LPA结果表明,其刺激指数值与鸡抗 E.maxima 再感染抵抗力有关。此反应可用于体外监测鸡体抗 E.maxima再感染的抵抗力。     

6株巨型艾美耳球虫繁殖力的比较研究

用巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)上海株、扬州株、南通株等不同地区的6株孢子化卵囊100个·只-1,经嗉囊接种7日龄无球虫黄羽公雏肉鸡,以麦克马斯特氏法计数感染后6～14d每天24h排出的卵囊。结果表明:广州株排卵囊量最多,与凤阳株和龙岩株相近;上海株排卵囊量最少,与扬州株、南通株相近;广州株与上海株、扬州株和南通株均差异显著。各虫株的显露期相似,在感染后第7天排卵囊量达峰值,第6～8天排出的卵囊量占总量的80%～90%,第10天接近0。     

巨型艾美耳球虫纯种的分离鉴定和致病性观察

采用单卵囊分离技术,从长春市某鸡场鸡球虫混合感染样品中获得1株纯种球虫,鉴定为巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima).鉴定指标寄生于小肠中段、卵囊为卵圆形、卵囊大、金黄色.测200个卵囊的平均大小为(22.5-37.5)×(17.5-29.5)μm,形态指数为1.27.卵囊窄端有一颗折光性强的极体,无内外残体.测200个孢子囊大小为(16.5-19)×(8-10)μm.最短孢子化时间为31h,潜伏期132h.用此卵囊对40只2周龄的海兰公鸡分为一个不感染组和4个感染组,每只口服感染1万、2万、5万和10万个孢子卵囊.结果所有感染组与对照组的平均增重差异均为显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01).     

鸡巨型艾美耳球虫早熟株选育及其生物学特性研究

为选育鸡巨型艾美耳球虫(E.maxima)早熟株,并对其生物学特性进行研究,采用早熟选育法对E.maxima亲本株进行连续鸡体传代以获得早熟株,再分别将鸡E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊以不同剂量口服接种14日龄无特定病原(SPF)雏鸡,测定E.maxima亲本株和早熟株的潜隐期、卵囊形态大小,并分析比较其致病性强弱和繁殖力高低。结果表明,成功选育出潜隐期为113 h的鸡E.maxima早熟株,其卵囊长和宽均显著小于亲本株卵囊。在整个试验过程中,各组鸡接种E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊后均无死亡现象;当鸡E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊接种剂量为0.5×10~4～20.0×10~4个/羽时,等剂量下E.maxima早熟株组鸡的相对体质量增加率显著大于亲本株组;接种量在10.0×10~4～20.0×10~4个/羽时,等剂量下E.maxima早熟株组鸡的肠道病变记分显著低于亲本株组;随接种剂量的增加,E.maxima亲本株和早熟株组鸡的相对体质量增加率逐渐降低,临床症状逐渐加重。此外,相同接种剂量下,E.maxima早熟株组卵囊产量均显著低于亲本株组,前者卵囊产量是后者的60%～75%;但随接种剂量的增加,E.maxima亲本株和早熟株组单卵囊繁殖力均呈下降趋势。综上,选育的鸡E.maxima早熟株与亲本株相比,致病力减弱、繁殖能力降低,能够为球虫多价活疫苗提供E.maxima虫种,以进一步加强鸡球虫病的防治。     

鸡布氏艾美耳球虫致病性研究

用18日龄公雏作为试验对象,以增重,病变和死亡为判定指标,用 E.brunetti 的0.5万、1万、5万、10万、20万、50万和100万/只为接种梯度,研究了布氏艾美耳于虫的致病性.结果表明:接种0.5万～20万/只剂量的 E.brunetti 都明显影响鸡的增重.与对照组相比,均存在极显著性差异(P<0.01),各剂量组间增重无差异,50万/只和100万/只剂量组的鸡出现减重.50万/只剂量组鸡死亡50%,100万/只剂量组鸡死亡100%.E.brunetti 接种5万/只剂量组及以上各组鸡饮食欲消失.鸡失去自洁行为.粪量少,含有粘液和血液.剖检病变主要在小肠至直肠,肠壁变薄,易碎,呈粉红色至暗红色,肠粘膜上有小的出血点,肠内容物以粘液和血液为主.部分鸡的盲肠内容物干、呈暗红色.病变计分为:对照组0分,0.5万/只为0.67+;1万/只0.83+;5万/只1.17+;10万/只1.50+;20万/只2.23+;50万/只3.64+;100万/只3.83+.100万/只剂量组中有两只鸡出现腿麻痹症状,不能站立.     

3株巨型艾美耳球虫免疫原性差异株 未孢子化卵囊蛋白的SDS-PAGE分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)比较分析了3株巨型艾美耳球虫免疫原性差异株未孢子化卵囊可溶性蛋白。结果显示,尽管所用的3株巨型艾美耳球虫在免疫原性上存在不同程度的差异,但3株巨型艾美耳球虫未孢子化卵囊可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图谱相似,至少有8条带,各带主次分明,其中有2条明显主带,分子量分别为42 000和39 000,还有3条较明显主带,分子量为36 000、26 000和22 900,其他可见带分别为109 800、86 900和62 800。结果表明SDS-PAGE电泳不能检测出E.maxima免疫原性差异株未孢子化卵囊可溶性蛋白的差异。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的制备及纯化试验

自实验感染堆型艾美耳球早熟减毒株卵囊的雏鸡小肠内容物中得到裂殖子悬液,在直径1.5cm、高5cm的DEAE52层析柱中,用PH7.6Tris—Hcl、以0.5～1.5ml/分钟流速洗脱纯化,得到纯净的裂殖子,回收率为50.49％～56.2％。     

抑制钙信号转导对柔嫩艾美耳球虫入侵细胞的影响

 【目的】探讨柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）入侵细胞与钙信号转导之间的关系,揭示鸡柔嫩艾美耳球虫病的发生机制。【方法】采用体外狗肾细胞（madin-darby canine kidney cell,MDCK细胞）培养技术,检测了细胞外缺钙、Ca2+内流阻断剂（硝苯地平）和钙调蛋白抑制剂（三氟拉嗪）对E. tenella子孢子入侵率的影响,并测定了培养细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）和细胞活性。【结果】E. tenella子孢子入侵细胞的抑制率随着细胞外Ca2+浓度的降低而升高。钙离子浓度降低到600 μmol•L-1时,入侵率（23.33%）均极显著低于对照组（P＜0.01）;细胞外无钙时,入侵抑制率高达53.18%;硝苯地平和三氟拉嗪均能极显著抑制子孢子的入侵（P＜0.01）,其中10 μmol•L-1的硝苯地平和50 μmol•L-1三氟拉嗪分别对子孢子的入侵抑制率达71.41%和97.13%,二者合用入侵抑制率可达98.59%。在E. tenella子孢子入侵细胞的过程中,MDCK细胞的活性均在90%以上,与对照组差异不显著（P＞0.05）,接种E. tenella子孢子的MDCK细胞培养液中LDH的活性与未接种的活性差异不显著（P＞0.05）。【结论】细胞外钙缺乏、钙通道阻断剂硝苯地平和钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪对E.tenella子孢子入侵MDCK细胞均有抑制作用,但子孢子入侵对MDCK细胞的活性无明显影响。     

鸡柔嫩艾美耳球虫绵阳地方株的分离鉴定及致病性研究

运用单卵囊分离提取技术,从绵阳某鸡场艾美虫感染粪便中获得1株纯种艾美虫卵囊,该艾美虫主要寄生在鸡盲肠,卵囊绝大多数呈宽卵圆形,无卵膜孔,有1个圆形极粒位于窄端,无内外残体,孢子囊有斯氏体,最短孢子化时间为19 h .通过随机测定200个卵囊后发现,卵囊的大小为(18.4～25.5) μm×(14.6～20.2) μm,平均大小为(21.62±2.08) μm×(18.15±1.83) μm;随机测定200个孢子囊后发现,孢子囊大小为(10.5～12.6) μm×(5.1～6.8) μm,平均大小为(11.77±0.87) μm×(6.29±0.69) μm.雏鸡在感染后5 d开始拉血便,6 d后症状加剧,鸡出现死亡.对照国内外相关文献,初步确定分离出来的艾美虫为鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella).对分离虫株卵囊致病性的研究结果表明,鸡一旦感染,其体重会受到影响,严重感染则会造成大量死亡.随着卵囊感染量增多,雏鸡死亡率也随之增高,当雏鸡感染量为8.0万个卵囊时致死率高达100%,表明所分离的柔嫩艾美耳球虫绵阳株致病力很强.     

布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染后鸡血清生化指标变化的研究

以15日龄公雏作为试验对象,利用 TECHNIOON RA-1000SYSTEM 血液生化分析仪,研究了鸡在人工感染 E.brunetti(41 500个卵囊/只)、E.maxima(42000个卵囊/只)和 E.acervulina(42500个卵囊/只)后3,5,7,9和11d 时其血清中葡萄糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶、尿酸、总蛋白、白蛋白、钙和镁的变化.结果表明:E.brunetti,E.maxima 和 E.acervulina 感染鸡后均可使其血清谷丙转氨酶活性升高,(E.     

鸡柔嫩艾美耳球虫对宿主细胞凋亡的影响

为了研究柔嫩艾美耳球虫入侵与宿主细胞之间的相互关系,用纯化的柔嫩艾美耳球虫子孢子与MDBK细胞共培养,使球虫子孢子入侵MDBK（Madin-Darby bovine kidney）细胞,用终浓度6%乙醇进行凋亡诱导,通过Annex-in V/PI双荧光染色法和流式细胞术（FCM）对MDBK细胞凋亡水平进行检测。试验结果证明子孢子入侵细胞后,有子孢子入侵的细胞凋亡诱导显著被抑制（P〈0.05）,而未有子孢子入侵的细胞相继被凋亡诱导剂诱导凋亡。进一步揭示柔嫩艾美耳球虫子孢子具有独特的机制来延长宿主细胞的存活时间来确保它们能在细胞中存活并发育。     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.