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1.
猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。 相似文献
2.
首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。 相似文献
3.
通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。 相似文献
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利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。 相似文献
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《南京农业大学学报》2014,(2)
根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。 相似文献
8.
为构建能稳定高效表达中华蜜蜂气味受体AcerOr2的重组表达载体,并在Sf9昆虫细胞中表达,将目的基因AcerOr2和昆虫表达载体pIB/V5-His用BamHⅠ和EcoRⅠ做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含目的基因AcerOr2的表达载体pIB/V5-His-AcerOr2。将重组DNA用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞中,利用Western blot和免疫荧光检测AcerOr2蛋白的表达和亚细胞定位情况。结果表明,成功构建重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2并建立稳定转染细胞系;Western blot结果证明,重组表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达,融合蛋白相对分子质量为56 ku左右;免疫荧光显示,重组表达载体在Sf9细胞膜上表达,与预测结果一致。说明构建的重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2能在Sf9细胞中稳定表达,为进一步研究中华蜜蜂气味受体AcerOr2的功能奠定了基础。 相似文献
9.
从已构建的质粒pGEM-MTCgp85中酶切回收ev/Jgp85基因,通过构建杆状病毒转移载体pFast-Bacl-ev/Jgp85和重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev/Jgp85,将ev/Jgp85基因转入Bac-to-Bac高效真核表达系统的Sf9昆虫细胞进行真核表达。间接免疫荧光试验显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞出现与野生型杆状病毒感染的Sf9细胞阴性对照明显不同的亮绿荧光;Western blot分析DAB显色,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35ku的阳性条带。结果表明,内源性ev/Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别。 相似文献
10.
《江苏农业学报》2014,(1)
为同时在昆虫细胞中按照合适比例表达禽腺联病毒的3个结构蛋白质,首先根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转移载体pFastBac-VP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP。SDS-PAGE结果分析表明,3个结构蛋白质VP1、VP2和VP3均获得了表达,分子量正确,且比例为1∶1∶10。Western blot结果显示,表达的重组蛋白质能够与VP3多抗反应。以上结果说明禽腺联病毒的3个结构蛋白质均在昆虫细胞中获得了成功表达。 相似文献