小麦avenin-like type-B 基因启动子的分离及表达载体的构建

根据已知的小麦ALP type-B基因序列,采用反向PCR技术,从小麦品种鄂恩1号(En1)中克隆得到了ALP type-B基因的上游启动子序列1664bp.通过PLACE和plantCARE等数据库对所克隆的启动子进行生物信息学分析,发现该启动子除具备启动子的基本元件如TATA-box、CAAT-box等外,还含有胚乳特异性表达的特有元件如Endosperm motif、GCN4-1ike motif (GLM)、RY motif和G-box等.用ALP type-B启动子置换质粒pBI121上的35S启动子,将其与gus基因连接构建植物表达载体.     

小麦高分子量谷蛋白1Dx2基因启动子的克隆及功能鉴定

以小偃6号基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应扩增到1kb左右的核酸序列,将其克隆到pMD18-T载体上。经测序鉴定及序列分析后得知,该片段为小麦高分子量谷蛋白基因(HMW-GS1Dx2)上游启动子及信号肽编码区,共1050bp。将其与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入小麦未成熟种子及叶片,检测其瞬时表达活性。组织化学检测表明,由该启动子驱动的GUS融合基因能在种子中表达,而在叶片中却未见表达,从而证实此HMW-GS1Dx2启动子具有在小麦胚乳中高效表达的活性,为小麦胚乳生物反应器的研究奠定了基础。     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

农杆菌介导小麦遗传转化影响因素的研究

选用河南科技学院近年来选育的小麦品种百农160的成熟胚愈伤组织和农杆菌菌株LBA4404,对农杆菌介导遗传转化中农杆菌浓度、感染时间、乙酰丁香酮浓度、头孢霉素质量浓度等几个重要影响因素进行了研究,建立小麦高效转化体系.结果表明.菌液OD<,600>=0.6,侵染时间30min时对愈伤组织的生存和转化最有利;浓度为200...     

小麦HMW-1Bx17基因启动子的功能验证

[目的]小麦HMW-1Bx17基因是在小麦胚乳中特异高表达的基因,该基因启动子的获得可为进一步研究小麦高分子量麦谷蛋白种子特异表达的调控模式提供基础材料,并为小麦品质改良的基因工程研究奠定基础。[方法]本文以改良的CTAB法提取小麦"舜麦1718"基因组DNA为模板,根据已知序列设计引物,利用嵌套PCR扩增1Bx17基因启动子片段。构建1Bx17基因启动子启动下的GUS(β-葡糖苷酸酶)基因表达载体,用基因枪法分别导入小麦根、茎、叶、胚乳及胚中进行瞬时表达,同时构建了1Bx17基因启动子驱动的抗菌蛋白Gnk2-1基因表达载体用于小麦幼胚稳定转化。[结果]X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦胚乳中特异表达。通过对再生抗性植株的RT-PCR鉴定,初步表明已获得转基因植株,并进一步证明了启动子的驱动功能。[结论]本文所获得小麦1Bx17基因的启动子在小麦基因工程遗传改良等方面具有一定的利用潜力。     

玉米Ubiquitin启动子的克隆及功能鉴定

根据Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列,设计引物从玉米自交系18红中克隆出该启动子,测序证明与发表的序列具有98%的同源性,并构建了带有该启动子和GUS基因的植物表达载体,将重组质粒导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法转入烟草和小麦愈伤中,通过GUS染色反应,证明克隆的启动子在单子叶和双子叶植物中均有活性。     

基于农杆菌介导的小麦遗传转化体系的影响因素的分析

对用农杆菌介导法进行小麦的遗传转化中,小麦的基因型、外植体种类、农杆菌侵染条件、添加酚类化合物、表面活性剂、超声波和抽真空几个重要影响因素进行了分析,为建立小麦高效遗传转化体系奠定了基础。     

小麦甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的转化及表达

利用农杆菌介导法将小麦甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)导入了烟草(Nicotiana tobaccum L.)NC89品种,该基因由35S启动子控制,PCR和PCR-Southern证明外源BADH已导入烟草基因组,平均转化频率80%;低温处理后转基因植株中BADH活性差异较大,最高的达到4.8 nmol·mg-1 protein·min-1,而在有些转基因植株中没有检测到BADH活性.     

小麦及其近缘物种中类燕麦储藏蛋白Avenin-like基因的克隆综述

介绍了小麦的品质及品质的形成、小麦的储藏蛋白及储藏蛋白的分类.综述了近年来关于类燕麦储藏蛋白Avenin-like基因发现、Avenin-like基因的胚乳特异性表达的时空表达模式以及Avenin-like基因的启动子的作用元件和时空表达特异性研究.     

几种基因转移技术在小麦上的应用

采用基因枪法、电脉冲法、农杆菌介导法和浸泡法将外源基因质粒ｐＺＦＸ２导入小麦细胞中,经卡那霉素筛选,获得了抗生的愈伤组织和再生植株。通过此项试验,研究了不同方法的转化效果,摸索了适宜的小麦基因转化条件。     

玉米蔗糖合酶基因启动子的克隆及功能分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,Su Sy)是植物蔗糖代谢中的一类关键酶,在植物的生长发育过程中具有重要功能。以玉米自交系"B73"的基因组DNA为材料,通过PCR扩增出玉米蔗糖合酶基因SH1起始密码子上游1853 bp序列。生物信息学结果显示该序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与干旱诱导的MYB结合位点,根、胚乳等器官表达响应元件。构建了由SH1启动子驱动报告基因Gus的植物表达载体,通过农杆菌介导法产生了水稻转化株系,Southern印迹结果显示获得了单拷贝的"中花11"转基因植株(PSH1)。组织化学分析和实时荧光定量PCR结果表明,Gus基因在根、茎、叶、叶鞘及颍壳中高效表达,但在花和种子中不表达。综上可知,SH1启动子是一个新颖的营养器官特异型启动子,在作物的品质改良中具有良好的应用前景。     

小麦TaPR1基因启动子的克隆及启动活性分析

PR1是植物病程相关（Pathogenesis related,PR）蛋白家族成员之一,参与植物抗病防御反应。研究前期明确了小麦TaPR1基因受叶锈菌及信号分子水杨酸（Salicylic acid,SA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）的诱导表达。本研究基于中国春小麦数据库,克隆获得了小麦TaPR1基因上游2 200 bp启动子序列,对启动子区域所包含的顺式作用元件进行分析预测,利用β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase,GUS）组织化学染色、绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）观察对不同长度启动子区段进行启动活性验证,结果表明TaPR1基因启动子-2 200～-290 bp区段具有启动活性,为进一步解析TaPR1基因转录调控机制提供了理论依据。     

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。     

水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

lncRNA 基因At3NC026490 启动子克隆与功能分析

lncRNAs是一类长度大于200 nt的非编码RNA,它们通过调控基因表达或直接影响蛋白功能,在植物生长发育与胁迫响应过程中发挥重要作用。At3NC026490是拟南芥中的一个lncRNA,目前尚未见该lncRNA功能方面的报道。从启动子角度对At3NC026490的功能进行探索,首先利用生物信息学手段分析At3NC026490启动子的特性,发现该启动子具有响应光、激素、胁迫等作用元件;随后构建At3NC026490启动子驱动GUS基因的表达载体并转入拟南芥中;GUS染色分析表明转基因株系的根、幼苗、叶等营养组织以及花器官的花瓣具有明显的GUS表型,而在不同发育时期的种子中并未观察到GUS表型,说明该启动子具有典型的组织驱动特性,表明At3NC026490基因可能在应答光、激素、胁迫刺激以及特定组织中发挥作用,该研究为后期深入阐释lncRNA的功能提供了重要信息和研究思路。