牛红细胞源抗菌肽的分离纯化与活性鉴定

【目的】分离纯化牛红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs),并对其体外抗菌活性进行初步检测。【方法】以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化抗菌肽,用琼脂糖平板扩散法测定其抗菌活性,并用质谱法测定其分子质量。【结果】牛血液红细胞粗提物经离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性;阳离子峰经RP-HPLC纯化后,共得到4个峰(F1、F2、F3和F4),其对大肠杆菌均具有抗菌活性,F1峰和F3峰对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅F1峰对白色念珠菌具有抗菌活性;经质谱分析,F1峰纯化肽的分子质量为2 562.40 u。【结论】成功地从牛红细胞中分离纯化到了AMPs;F1峰中AMPs的抗菌谱较广,抗菌活性较强。     

1株天然抗菌肽的纯化及活性检测

从牛血液中制备血红蛋白粗提物,运用离子交换层析和反相高压液相色谱法纯化抗菌肽,用琼脂糖弥散法测定其抗菌活性.结果表明:通过离子交换层析获得的阳离子峰具有抗菌活性,通过反相高效液相色谱对阳离子峰进行分离,获得6个峰,其中F1、F2、F4和F6峰对大肠杆菌具有活性,F1、F2和F6对金黄色葡萄球菌具有活性,仅F2对白色念珠菌具有活性,表明F2抗菌肽具有较为广谱的抗菌活性.     

鸡白细胞中抗菌肽的分离纯化及活性鉴定方法的建立

【目的】建立鸡白细胞中抗菌肽的分离纯化及活性鉴定方法。【方法】通过腹腔注射酪蛋白生理盐水,从鸡人工腹水中得到白细胞;将收集的白细胞,通过超声波反复破碎、体积分数10%乙酸浸提、低温高速离心、旋转蒸发除去乙酸和冷冻干燥等方法,得到抗菌肽粗提物;将得到的粗提物,经CM-Sepharose Fast Flow弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,收集分离的各组分,使用微量琼脂糖弥散法检测各组分的抗菌活性和最小抑菌浓度。【结果】共获得鸡抗菌肽粗提物0.270 g,经RP-HPLC分离纯化,抗菌肽离子交换阳性组分共分离出18个峰,其中6个峰对3种细菌均表现较强的抑菌活性,对鸡大肠杆菌E.coliO78(峰13)、金黄色葡萄球菌S.au-reus1056MRSA(峰15)和白色念珠菌C.albicansATCC10231(峰15)的最小抑菌浓度分别为0.627,0.001和0.035μg/mL。【结论】该法可以在实验室中用于鸡抗菌肽的提取及活性鉴定。     

杂合抗菌肽Scy-Hep3在毕赤酵母中的分泌表达及其抗菌活性

为获得体外稳定表达的高抗菌活性新型抗菌肽,通过重叠延伸PCR技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin (简记为Scy)和斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin 3 (简记为Hep3)的杂合抗菌肽基因scygonadinhepcidin3 (简记为scy-hep3),将scy-hep3与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-scy-hep3,用电转化法将其转化至毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽Scy-Hep3,并进行抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-scy-hep3,用体积分数为0. 5%的甲醇诱导表达24 h,分泌表达上清液中获得了稳定表达的相对分子质量约24 000的表达产物,与预期杂合抗菌肽Scy-Hep3的大小相符;抗菌活性结果表明,杂合抗菌肽Scy-Hep3具有广谱抗菌活性,对被测的3种革兰氏阳性菌(溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和4种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和弗氏志贺氏菌Shigella flexneri)具有较强的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC12μmol/L);对比于单一的抗菌肽Scy和Hep3,杂合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性显著增强。本研究结果将为杂合抗菌肽Scy-Hep3的生产和开发应用提供数据资料。     

五谷虫抑菌活性多肽RP-HPLC分离与纯化方法研究

旨在建立一种五谷虫抑菌活性多肽分离纯化的方法,为研究其药用价值提供实验依据。通过匀浆、过滤、加热、离心后利用超滤膜超滤获得分子量在30 ku以下的蛋白多肽,采用凝胶过滤层析系统初步分离并筛选出抑菌活性峰,以RP-HPLC建立该活性峰的分离纯化方法。结果显示,凝胶过滤层析法分离并且筛选出两个具有抑菌活性组分S2和S3;RP-HPLC色谱法确定了S2具有7个峰和S3具有4个峰;该方法稳定性、精密度、重复性实验的保留时间与峰面积的RSD值均小于5%;6批样品RP-HPLC图谱相似度值大于0.99;采用RPHPLC能快速分离五谷虫抑菌活性多肽,且该方法稳定、可靠、重复性好。     

仙人掌抗菌肽的筛选、分离纯化及性质研究

目的:研究仙人掌植物是否具有起抑菌作用的抗菌肽,并对其进行分离纯化和部分性质研究。方法:采用梯度盐析的方法提取6种仙人掌不同饱和梯度硫酸铵沉淀的蛋白质组分进行抑菌性试验,筛选蛋白质组分具有抗菌效果的仙人掌品种。用Sephadex G-75和Sephadex G-25柱层析对抗菌效果最为显著的蛋白质组分进一步分离纯化,并对纯化到的具有抗菌活性的多肽物质进行分子量、理化性质和抗菌活性检测。结果:发现4种仙人掌中存在对金黄色葡萄球菌有抗菌作用的小分子量蛋白质成分。其中金手球所含蛋白质组分的抗菌效果最为显著,并从中分离纯化得到具有抗菌活性的多肽物质,命名为MH-AMP-1。MH-AMP-1的分子量(Mr)约为8511 Da,在pH 2.5~7.5的乙酸铵缓冲液中抗菌活性强,且具有一定的热稳定性,对检测的病原菌具有广谱抗菌活性。     

黄粉虫抗菌肽的生物学性质及初步分离纯化

［目的］探索黄粉虫抗菌肽的生物学性质。［方法］通过菌液注射对黄粉虫幼虫进行抗菌肽的诱导,对其热敏感性、反复冻融的稳定性、抑菌活性的适宜pH值及部分抑菌谱进行测定,并对黄粉虫血淋巴抗菌肽进行了初步的分离纯化。［结果］黄粉虫抗菌肽热稳定性好,反复冻融对其活性影响不大,显示出一定的抗酸碱性能,在pH为5时抑菌效果最佳,对测试的6种动物病原细菌均有不同程度的抑制作用,特别是对猪致病性大肠杆菌和猪链球菌,具有较强的抑菌活性。经SephadexG-25凝胶过滤柱层析分离得到3个活性峰,表明黄粉幼虫血淋巴中有多个抗菌活性组分。［结论］该研究为黄粉虫抗菌肽的利用奠定了理论基础。     

一个家蝇抗菌肽的分离纯化

以野生家蝇干燥幼虫为原料,在常规的生化提取基础上,通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进一步纯化,并结合电洗脱技术,利用灵敏的杀菌活性检测手段,从家蝇抗菌肽总组分中分离纯化出1个20 ku的抗菌肽,对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌均有杀灭作用。     

三步层析法分离毕赤酵母工程菌中表达的新疆家蚕抗菌肽

通过离子交换层析、疏水作用层析和分子排阻层析等三步层析的方法,分离纯化了毕赤酵母工程菌所表达的新疆家蚕抗菌肽.结果表明,三步层析后,SDS电泳显示单一条带,分子量约为7.0 kDa;所纯化的新疆家蚕抗菌肽具有较强的抗菌活性.该纯化工艺的建立,为新疆家蚕抗菌肽在饲料添加剂、农用抗生素等方面的广泛应用奠定基础.     

贻贝抗菌肽的分离纯化

[目的]从贻贝中提取具有抗菌作用的多肽。[方法]以紫贻贝为原料,采用0.5%的乙酸直接提取方式提取抗菌肽,再经过Sephacryl S-100聚丙烯酰胺凝胶色谱进行纯化,收集各馏分并用滤纸片扩散法测定其抗菌活性及对各种细菌的最低抑菌浓度,使用SDS-PAGE测定抗菌肽的分子质量,测定其在100℃条件下不同处理时间和不同pH条件下抗菌活性的变化。[结果]使用0.5%的乙酸作为提取液粗提取抗菌肽具有较高的提取效率,使用Sephacryl S-100纯化抗菌肽,可将抗菌肽纯化为单一物质。分离纯化出的贻贝抗菌肽具有较强的抗菌性,分子质量为5 908,且具有耐高温、耐酸碱的性质。[结论]该研究为抗菌肽的大规模生产奠定了基础。