大豆谷胱甘肽还原酶基因的扩增及连作胁迫应答

利用数据库Phytozome获得大豆胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）基因4个成员的编码序列（Coding sequence, CDS）序列,以大豆叶片和根中RNA为模板,经RT-PCR扩增获得[STBX]Glyma10g03740和Glyma02g16010[STBZ]基因,二者大小均为1 638 bp,基因结构相似;获得[STBX]Glyma16g27210和Glyma02g08180[STBZ]基因,二者结构相似,基因大小均为1 506 bp。系统进化分析显示,Glyma10g03740/Glyma02g16010和Glyma16g27210/Glyma02g08180蛋白聚类于不同分支,但分别都与豇豆、尖叶菜豆和芸豆亲缘关系最近。4个成员的结构域相同,均含有FAD/NAD-binding_dom结构域和Pyr_nucl-dis_OxRdtase_dimer结构域。三级结构显示Glyma16g27210和Glyma02g08180构象相似,Glyma10g03740和Glyma02g16010构象相似,4个蛋白均以二聚体结构存在,互作蛋白完全相同,包括2个硫氧还蛋白还原酶和8个硫氧还蛋白。RT-qPCR方法分析GRs基因对连作逆境的响应,结果显示,在连作胁迫下,敏感品种HF55的GRs基因表达在根中启动较早（出苗后15 d内）,而叶片中启动较晚,出苗后45 d时表达仍呈上升趋势;对于抗性品种KX8,根和叶片中GRs基因各成员均在出苗后15~45 d表达量达到最高,30 d时根中GRs基因总表达量增加达19.03倍,叶片中GRs基因总表达量增加2.50倍。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

柑橘黄龙病菌过氧化物还原酶基因CLasPrx的克隆及功能分析

为解析柑橘黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）逃逸活性氧伤害的机理,通过克隆其过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）编码基因的全长序列,对CLasPrx蛋白序列进行生物信息学分析、多重比对及系统发育分析,采用实时荧光定量PCR方法检测CLasPrx基因在柑橘不同组织中的表达模式,并在本氏烟Nicotiana benthamiana叶肉细胞瞬时表达CLasPrx分析其编码蛋白的亚细胞定位,利用碘化钾法测定 CLasPrx 蛋白清除 H₂O₂的活性。结果显示,克隆得到的CLasPrx基因序列全长为534 bp,编码177个氨基酸;CLasPrx蛋白包含1个Redoxin保守结构域;多重比对分析发现CLasPrx蛋白活性位点含有保守基序PGAFTPTC;系统发育分析表明CLasPrx蛋白与近缘物种的同源蛋白聚为一类;CLasPrx基因在感染黄龙病柑橘树秋梢中的表达水平显著高于在春梢中的表达水平;CLasPrx定位于本氏烟叶肉细胞的细胞质基质中;过表达CLasPrx蛋白能够显著降低本氏烟叶肉细胞内H₂O₂的含量。表明CLasPrx可能参与柑橘黄龙病菌清除H₂O₂的过程。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

两个转W23基因小麦株系的抗旱性鉴定

以两个T₅代转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61为材料,在水培条件下采用PEG-6000人工模拟干旱胁迫措施对转基因小麦株系的根系发育特点、抗旱相关的光合生理等指标进行了测定。结果表明,干旱胁迫条件下各参试小麦的光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)均下降,转基因株系降幅较小,且其Pn和Tr值极显著高于受体品种;在正常供水和干旱胁迫两种水分处理下,转基因株系均比受体品种具有较发达的根系,其根总长、根总表面积、根总体积等参数极显著高于受体品种。这一结果说明,转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61在苗期依靠发达的根系维持较强的光合作用,提高其应对干旱胁迫的能力。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20（GdHsp20.6）完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温（-10~5℃）和高温（35~40℃）处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30~120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。     

东北日光温室葡萄园水热通量特征及其对气象因子的响应

运用温室葡萄水热平衡观测资料,分析了东北日光温室葡萄的能量平衡和能量分量日变化、生育期变化以及分配规律,同时也分析了潜热通量（λET）对环境因子的响应。结果表明：水热通量各分量在整个生育期日变化总体上呈现为单峰趋势,净辐射（R_n）的峰值最大为618.75 W·m^-2,λET峰值最大为242.73 W·m^-2,感热通量（H）峰值最大为327.93 W·m^-2;在新梢生长期,白天λET较小,为34.55 W·m^-2,随着生育期推进,λET逐渐增大,在果实着色成熟期达到最大值（78.49 W·m^-2）之后减小;H在各生育期能量中均占了绝大部分;白天潜热通量占净辐射的比例（λET/R_n）在新梢生长期最小,为25.28%,在果实着色成熟期最大,为44.17%;感热通量占净辐射比例（H/R_n）整个生育期几乎都达50%以上,土壤热通量占净辐射比例（G/R_n）相对较小,变化范围为4.46~12.32 W·m^-2;在整个生育期能量比率大小依次为H/R_n>λET/R_n>G/R_n。在不同生育阶段瞬时尺度上,R_n是影响潜热变化最主要的气象因子,R²高达0.88。在日尺度上,各气象因子对潜热通量的影响在逐渐变弱,相对湿度（RH）与λET相关系数仅为0.28。但无论从瞬时尺度还是日尺度,R_n都是影响潜热通量最主要的气象因子。各气象因子对潜热通量的影响大小依次为：R_n>VPD>T_a>RH。     

马铃薯气孔密度表皮模式因子StSTOMAGEN的克隆和功能分析

为了研究马铃薯EPFL9/StSTOMAGEN基因在气孔发育过程中的功能,从马铃薯品种大西洋中克隆得到气孔密度表皮模式因子StSTOMAGEN,将其通过农杆菌介导的遗传转化方法,在拟南芥中异位表达,对该基因的表达特性及功能进行分析。结果显示：StSTOMAGEN主要定位于细胞间隙和细胞核,并且它在顶端未展开叶中表达最多,表达量在1 d中呈现周期性变化,长日照条件下（16 h/8 h,光/暗）,在授时因子为20 h时表达量最高;聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫处理4 h后其表达量达到最高,而脱落酸（ABA）和NaCl胁迫处理后,其表达水平呈现出持续降低的趋势。功能鉴定表明,过表达StSTOMAGEN基因的拟南芥（ST）相对于野生型（WT）气孔密度增大63%~83%,光合速率增大36%~42%。此外,ST植株离体叶片的水分散失速率增大24%~55%,离体叶片H₂O₂含量也显著升高,约为野生型的50%~100%。干旱胁迫下,ST株系的光合速率、F_v/F_m和瞬时水分利用效率都显著低于野生型,其中光合速率降低55%~66%,F_v/F_m降低22%~50%,瞬时水分利用效率降低11%~12%。综上结果可知,表皮模式因子StSTOMAGEN通过正调控气孔密度而降低植物的抗旱性,该结果为后期通过基因编辑技术降低StSTOMAGEN基因的表达,培育抗旱节水型马铃薯新品种奠定理论基础。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。     

靶标抗性点突变基因型检测技术

杀虫剂的不合理使用导致害虫的抗药性日趋严重。抗药性是一种涉及一个或几个昆虫基因的遗传特征。靶标抗性通常与点突变相关,对抗性相关的点突变的快速检测诊断是抗性治理的基础之一。评述了5种基因型检测技术——单链构象多态性、固相微型测序、双向等位特异PCR扩增、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序的优缺点及其在突变检测中的应用。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

东亚小花蝽若虫对西花蓟马若虫的捕食作用

在室内条件下进行东亚小花蝽2、4龄若虫对西花蓟马若虫的捕食功能反应与搜寻效应试验.结果表明在供试温度下,其捕食功能反应均符合Holling Ⅱ型方程;相同温度下,东亚小花蝽若虫的捕食量随猎物密度的增加而增加,而搜寻效应随之降低.相同猎物密度条件下,18～26℃之间,随着温度的升高,东亚小花蝽若虫对西花蓟马若虫的捕食量增加、搜寻效应增强;而在26～30℃之间,趋势相反.26℃时,东亚小花蝽2、4龄若虫日捕食量最大,捕食上限分别达18.2头和38.2头;处置1头猎物所需时间(Th)最低,分别为0.0549天和0.0262天;瞬时攻击率(a)s最高,分别为1.0574和1.3665.东亚小花蝽2、4龄若虫捕食作用率与其密度的关系分别为E=0.4034P-0.6669和E=0.3851P-0.4767;分摊竞争强度与其密度的关系分别为I=1.01671gP 0.0172和I=0.80881gP 0.0142.     

兰州市城区空气气溶胶中PM_(2.5)和PM_(10)污染状况分析

为了调查兰州市空气中颗粒物PM2.5的污染水平,于2008年夏秋、冬季在兰州市一交通主干道附近使用大气采样仪采集了32个样品。结果表明:兰州市PM2.5、PM10的污染状况严重,超标率分别为32.3～167.7%和23.1～480%;对人体和环境影响较大的PM2.5占PM10的比例范围从62.10～77.41%,而且呈现逐年增加的趋势。我国目前对于PM2.5的相关控制标准尚处于论证、试点研究阶段,使得对它的控制越发困难,应当引起公众和相关部门的高度重视。     

籼、粳稻上分离的稻瘟病菌致病性分析

从100余个稻瘟病菌单孢株中选择代表近年来在浙江省水稻上出现的主要小种的10个菌株，分别来自6个籼稻和4个粳稻品种。将10个菌株分别接种到230个籼稻和183个粳稻品种上，研究从籼、粳稻上分离的稻瘟病菌（籼、粳菌）的致病性。籼菌主要侵染籼稻，侵染后中等发病和重发病的品种比例分别为25．22％和12．61％。均高于侵染粳稻后这两种发病程度的品种比例；粳菌主要侵染粳稻，侵染后重发病的品种比例为40．44％，明显高于侵染籼稻后重发病的品种比例。在籼稻中被籼菌侵染后发病比被粳菌侵染后发病重的品种占籼稻总数的69．57％，并且被籼菌侵染后轻发病、中等发病和重发病的品种比例均明显高于被粳菌侵染后这几种发病程度的品种比例；在粳稻中被粳菌侵染后发病比被籼菌侵染后发病重的品种也占有较大的比例，在被籼菌侵染的发病品种中以轻发病的品种为主，在被粳菌侵染后的发病品种中以重发病的品种为主。     

Movement of fluometuron, simazine, 36Cl− and 144Ce3+ in soil under field conditions: qualitative aspects

The distributions of two herbicides and two radioactive ions in field plots at two sites were determined at periods up to 187 days following surface applications in the spring. The results demonstrated the variability characteristic of field situations. At one site some fluometuron moved a short distance down the profile but after 187 days most remained above 6 cm whereas at the other site there was essentially no movement below 3 cm. At both sites simazine was almost entirely confined to the top 3 cm. The adsorption characteristics of the two compounds are similar so the greater mobility of fluometuron is probably a consequence of its greater solubility, Measurements of ³⁶Cl^? indicated a significant movement of water through the 30 cm depth studied. ¹⁴⁴Ce³⁺ used as a tracer of soil particles was of similar mobility to simazine. In general the movement of chloride and the two herbicides can be interpreted in terms of the concept of mobile and immobile fractions of soil water in which a proportion of the mobile water does not reach equilibrium with solutes in the bulk of the soil. Soil structural effects may therefore be more important than adsorption in controlling the movement of solutes and redistribution in association with soil particles can be significant. A parallel laboratory experiment showed that the results from a standard leaching column procedure did not necessarily indicate field performance.     

夹竹桃叶提取物对福寿螺的杀螺活性

从夹竹桃叶中筛选杀灭福寿螺的活性成分。采用浸渍法研究了夹竹桃叶的乙醇粗提物和组分Ⅰ对不同日龄福寿螺的毒杀和抑制作用。结果表明:组分Ⅰ浸渍10、30和50日龄螺6 h的LC50值分别为2.86、5.87 和8.68 mg/L;浸渍24 h的LC50值分别为0.98、2.31和 3.16 mg/L,其中2 mg/L的组分Ⅰ浸渍10日龄螺24 h的死亡率为100%。乙醇粗提物对福寿螺的毒杀效果较差,用其100 mg/L浸渍10日龄和30日龄螺72 h的死亡率均为100%,浸渍50日龄螺120 h时,死亡率100%时的质量浓度达到200 mg/L。但乙醇粗提物和组分Ⅰ各浓度对福寿螺的活动均无抑制作用,反而有促进其上爬的作用。     

节节麦、鬼蜡烛——燕麦孢囊线虫的两种新寄主

禾谷孢囊线虫病(cereal cyst nematode,CCN)是由燕麦孢囊线虫Heterodera avenae Wollen.引起的一种重要的小麦病害,在世界上40多个国家均有发生[1].我国于1987年首次发现燕麦孢囊线虫[2],至2012年,已传播到湖北、河南、河北、北京、山东、山西、安徽、江苏、青海、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、天津、西藏、新疆等16个省市自治区[3],危害程度与范围呈逐年加重和扩大的趋势,已对我国小麦生产构成严重威胁.该病造成小麦平均减产20％～40％,严重时高达73％～89％[4].因此,CCN是制约小麦和大麦生产的主要因素之一.