湖北白猪IGF-1基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-1）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-1基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-1基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子,539～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-1基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-1基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

湖北白猪胃蛋白酶原A基因cDNA克隆与序列分析

根据Genebank公布的J04601猪胃蛋白酶原A序列,进行了引物的设计和筛选,通过RT-PCR获得了湖北白猪的胃蛋白酶原A的cDNA序列全长,共1 227 bp(已提交Genebank,登录号EF108301),其具有一个长度为1 158 bp的读码框,编码385个氨基酸,其中包含15个氨基酸组成的信号肽,成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成.与J04601比较,核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%.经PredictProtein分析表明,核苷酸和氨基酸的改变没有造成蛋白质二级结构和功能的变化;并对胃蛋白酶原A基因密码子使用频率和mRNA的二级结构进行了分析,为其载体和宿主的选择以及基因的改造奠定了分子生物学基础.     

猪Tetherin基因的克隆及序列分析

为研究猪Tetherin基因的功能,应用RT-PCR手段从感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪肺脏组织扩增得到猪源Tetherin基因,将其克隆到p MD19-T载体并进行测序,采用分子生物学软件将其编码的蛋白质序列与其他来源的Tetherin蛋白序列进行比对分析,采用真核转染的方法研究其在MARC-145细胞中的定位情况。结果显示,克隆得到的猪源Tetherin基因全长534 bp;猪源Tetherin蛋白与牛、绵羊、猫、人、黑猩猩、猫头鹰、猕猴Tetherin蛋白同源性分别为41.5%、44.1%、42.3%、43.7%、45.4%、35.6%、42.1%;猪源Tetherin蛋白为跨膜蛋白,该蛋白定位在MARC-145细胞的细胞膜中。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。     

白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

根据几种禾本科植物肌动蛋白基因的保守序列设计一对简并引物,以白羊草(Bothriochloa ischaemum)幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得一个肌动蛋白基因cDNA片段,命名为BiACT,该基因片段长度为720bp,编码240个氨基酸残基。氨基酸比对分析结果表明,BiACT基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。     

猪IRGC基因的克隆与序列分析

[目的]对猪IRGC基因进行序列分析,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]采用EST信息和测序相结合的方法分离了猪IR-GC基因,并与人、牛、犬和猩猩IRGC基因进行序列相似性分析。[结果]获得了1 558 bp的cDNA序列,其登录号为EU703776,与人、牛、犬和猩猩IRGC基因的序列分别有86%、90%、91%和84%的相似性。序列分析表明,该基因编码的464个氨基酸与人、牛、犬和猩猩的相似性分别达到了90%、93%、95%和90%。[结论]成功提取了猪IRGC基因,其具有人、牛、犬和猩猩类似的结构和功能。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的克隆新的猪MAPK12基因全长ORF,分析其生物特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法:以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列,将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果分离的ORF全长1101bp,编码367个氨基酸,与人鼠氨基酸序列92%同源;利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论研究分离的基因片段可命名为猪ERK6,通过分析,获取了该酶的基本信息特征,并与现有的报道结果进行对比分析,为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

猪Mx1基因cDNA的克隆及序列分析

 为获得云南本地猪Mx1基因cDNA序列,根据GenBank中猪Mx1基因的参考序列,设计合成3对引物。以云南本地猪外周淋巴细胞为样本,采用RT-PCR方法进行分段扩增,对扩增片段进行克隆,测序分析及序列拼接。结果表明,扩增的云南本地猪Mx1基因cDNA全长2546bp,开放阅读框1992bp,编码663个氨基酸,与GenBank中他猪种Mx1基因序列对比,核苷酸序列的同源性为99.4%～99.8%,氨基酸序列的同源性为98.8%～99.5%。成功获得云南本地猪Mx1基因的cDNA序列,为研究云南本地猪Mx1蛋白的抗病毒活性及作用机制奠定了基础。     

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。     

鸭IL-18基因克隆与序列分析

[目的]为深入研究鸭IL-18的基因表达及其生物学活性和分子佐剂的应用奠定基础。[方法]依据GenBank中香港鸭IL-18基因的序列设计1对特异引物,以广东水鸭脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆广东水鸭IL-18基因并进行序列分析。[结果]测序结果表明,广东水鸭的IL-18基因开放阅读框为603 bp,编码201个氨基酸,分子量为23.2 kDa。序列分析表明,所获得的广东水鸭IL-18基因与GenBank中香港鸭的核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为100%。它与鸡和火鸡的核苷酸同源性分别为86.9%和87.1%,而氨基酸同源性分别为96.5%和97.0%。[结论]进化树分析结果表明,鸭IL-18基因与鸡和火鸡进化关系较近。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

猪CRYZL1基因的克隆与序列分析

利用SMART-RACE方法,克隆了猪的一个新基因,获得1 506 bp的全长cDNA序列,NCBI登录号为EF576939。序列分析表明,该基因编码349个氨基酸,具有ADH-zinc-N和Qor结构域,与人、牛、小鼠的CRYZL1蛋白分别具有93%、95%、89%的同源性,被命名为猪zeta-crystallin(Quinone Reductase)-like 1(CRYZL1)基因。该基因克隆为进一步研究其功能打下基础。     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。