毛竹内生拮抗细菌筛选及其16S rDNA鉴定

通过平板对峙法、滤纸片法、牛津杯法对6种食用菌病原菌的拮抗效果进行了初筛和复筛,并观察了细菌菌落表征性状;进行了16S rDNA序列分析.结果表明,初步筛选出了JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16等8株具有初步拮抗效果的内生细菌;复筛出4株具有较好拮抗效果的内生细菌,菌株编号分别是JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07;4株内生拮抗细菌菌株分属于2属3种,分别为芽孢杆菌属(Bacillus)和短杆菌属(Brevibacterium).该研究为内生拮抗细菌开发、防病微生物菌剂的制备及应用提供了资源.     

基于16S rDNA序列的4株气单胞菌属细菌的分子鉴定

对分离自养殖水环境的4株气单胞菌属(A eromonas)细菌的16 S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,通过BLAST软件在GenBank中查找同源序列,应用MegAlign软件中的Jotun Hein、ClustalV以及ClustalW 3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega 4.0软件中的邻接法(NJ)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树.由Jotun Hein法可知,Aeromonas sp.T3与序列DQ817542.1、DQ817645.1以及HM127065.1相似度最高,均为99.2％,Aeromonas sp.T4与序列DQ816364.1、HM77846.1以及HM778618.1相似度最高,均为97.9％,A eromonas sp.T5与序列GQ205446.1相似度最高,均为99.4％,Aeromonas sp.T6与序列GQ205446.1相似度最高,为99.6％;其他两种方法的结果相似度略低.4种方法构建的系统发育树基本一致,可初步确立4株菌株的分类地位:Aeromonas sp.T3与序列DQ817542.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T4与序列HM778618.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T5与序列GQ232759.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T6与序列GQ205446.1亲缘关系最近.     

基于16S rDNA序列的4株假单胞菌属细菌的分子鉴定

对分离自养殖水环境的4株假单胞菌属细菌的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在Gen-Bank中通过BLAST查找其同源序列,应用MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V、Clustal W 3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega 4.0软件中的邻接法(N-J)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树。3种序列分析方法结果显示,由Jotun Hein法可知,菌株T3与菌株T6序列相似度最高为98.5%,菌株T4与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.1%,菌株T5与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas putida KF703及菌株T5序列相似度最高为99.1%;由Clustal V法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.0%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21、Pseudomonas sp.N9-1及菌株T5序列相似度最高为97.7%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为98.9%,菌株T6与菌株T5序列相似度最高为97.2%;由Clustal W法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高均为97.7%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为99.3%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicidaS21序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.9%。4种方法构建的系统发育树基本一致,可初步确立4株菌株的分类地位:菌株T3与Pseudomonas sp.G53亲缘关系最近,菌株T4与序列Pseudomonas sp.N9-1以及Pseudomonas sp.WP6亲缘关系最近,菌株T5与Pseudomonas sp.3-3(2010)亲缘关系最近,菌株T6与Pseudomonas plecoglossicida S21亲缘关系最近。     

生防细菌A57的鉴定及拮抗蛋白理化性质的研究

通过培养形态、生理生化特征以及16S rDNA的分子序列同源性分析,16S rDNA测序结果在GenBank数据库进行同源性比较,确定A57为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。采用不同浓度硫酸铵沉淀法提取拮抗蛋白。以枯萎病菌作指示菌,A57在70%的硫酸铵饱和度下拮抗蛋白的拮抗活性最大,抑制率为23.7%。对A57拮抗蛋白理化性质研究,结果表明该拮抗蛋白对热均稳定,对氯仿均不敏感,对胰蛋白酶敏感;A57拮抗活性最佳pH值为5～7,强酸(pH3)和强碱(pH9)条件下仍具有部分的拮抗活性。     

水稻稻瘟病拮抗细菌的筛选与鉴定

为筛选并鉴定水稻稻瘟病拮抗细菌,采用平板测定法筛选拮抗细菌,通过形态学观察、生理生化特征及16SrDNA序列分析鉴定菌株.结果表明:从水稻叶片、稻田土壤中共分离得到168株细菌,其中26株对稻瘟病菌有拮抗作用,8株具有强拮抗作用的菌株有,8个代表性的菌株对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌均表现了强的拮抗作用.选择拮抗性能最强的一个菌株T61,鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).本试验所筛选的枯草芽孢杆菌对3种主要的水稻真菌病害有显著的抑制效果.     

基于16S rDNA序列4株鸡源芽孢杆菌的分子鉴定

对分离自肉鸡肠胃的4株芽孢杆菌R1、R2、S1、H1的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在NCBI中通过Nucleotide BLAST查找其同源序列,应用DNAstar的MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V 、Clustal W3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega5.0软件中的最大似然法、邻接法、最小进化法、最大简约法构建系统发育树.序列差异和同源性分析结果显示:由Jotun Hein法可知,H1和R2与Bacillus subtilis DSM10同源性最高,达到100％;R1与B.vallismortis DSM11031同源性最高,达到99.7％;H1与B.subtilis DSM10的同源性为99.9％.由Clustal V法可知,H1与R2同源性最高,达到99.6％;R1与S1同源性最高、为98.7％.由Clustal W法可知,H1与R2同源性最高、为99.7％,R1与S1为99.4％.采用4种方法构建的系统发育树基本一致,可以确立4株鸡源芽孢杆菌的分类地位,R1、S1与B.subtilis BPRIST009、B.subtilis LXB3、B.vallismortis DSM11031之间关系最为亲近;R2、H1与B.subtilis CICC10076、B.subtilis DSM10之间关系最为亲近.     

热带土壤解磷细菌PSB26的筛选鉴定及拮抗初探

以有机磷液体培养基进行生物富集,无机磷固体培养基平板法从海南、广东、云南等地热带土壤中筛选出解磷效果较好的一株解磷细菌PSB26。通过细菌16S rRNA通用引物PCR扩增菌株的16SrDNA序列,测得该菌株的序列长度为1095bp,经B lastn搜索进行序列比对,结果表明：该菌株属于Klebsiella sp.。进一步的室内平板对峙培养实验表明,PSB26对Fusarium oxysporum piperis等11个供试病原菌中的6个具有不同程度的拮抗作用。     

内生拮抗细菌菌株Thyy1和Jcxy8的鉴定

为了明确从健康番茄植株中分离筛选的具有拮抗作用的细菌菌株Thhy1和Jcxy8的分类地位,采用常规方法对其进行了鉴定。根据两菌株的大小、形状和芽孢等形态学特征及其固体和液体培养性状观察,两菌株均属于芽孢杆菌属(Bacillus spp.);通过革兰氏染色、接触酶反应、好氧和厌氧性、碳水化合物的利用、柠檬酸盐和丙二酸盐的利用,硝酸盐还原和葡萄糖产酸等20个生理生化指标的测定,结果表明:菌株Thhy1属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn.),菌株Jcxy8属环状芽孢杆菌(Bacillus circulans Jord.)。     

番茄青枯病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

[目的]筛选出番茄青枯病菌的拮抗细菌,为番茄青枯病的防治提供参考.[方法]从番茄青枯病发病田块中的无病植株根际土壤中筛选获得拮抗细菌,通过形态和培养特征的观察、生理生化的测定和16S rDNA系列分析鉴定其分类地位,并通过盆栽试验验证其防效.[结果]从湖南省张家界市采集的番茄田土壤在NA培养基中分离出104株细菌,有6株细菌对青枯病菌有拮抗活性,其中1株拮抗菌菌株88号对青枯病病原菌有较强拮抗效果,抑菌圈达7.2 mm,其发酵液温室盆栽防效达96.4％,该菌株初步认定为伯克氏属(Burkholderiasp.).[结论]菌株88号在防治番茄土传病害上具有很好的应用前景.     

姜瘟病拮抗细菌的筛选与鉴定

2003年6月在雅安飞仙关多功乡13个未发病或发病较轻的生姜田块中分离到217个细菌菌株,通过平板抑菌试验筛选,其中3个菌株(L1、D4、T10)对姜瘟病有强抑菌作用,抑菌圈直径都在2.2cm以上。对L1、D4、T10菌株进行形态特征和生理生化鉴定,确定L1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、D4和T1为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。     

16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用

本实验利用16SrDNA序列分析技术,对来自犊牛腹泻粪便中的四株菌（A菌,B菌,C菌,D菌）进行菌种鉴定。使用16SrDNA通用引物,通过PCR扩增分别得到1500bp,与GenBank中序列进行比对。结果表明：A菌与肠杆菌属、B菌与短小芽孢杆菌、C菌与大肠杆菌、D菌与变形杆菌的同源性最高,相似率均达到了99％,初步确定A菌为肠杆菌属、B菌为短小芽孢杆菌、C菌为大肠杆菌、D菌为变形杆菌。本试验的目的是为16SrDNA在临床细菌的鉴定提供客观理论依据。     

拮抗放线菌111A202的种类鉴定及其16S rDNA序列分析

对分离自药用植物假橐吾的一株拮抗放线菌菌株111A202进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分分析及16 S rDNA序列分析.结果表明该菌基内菌丝无横隔、不断裂,气生菌丝分枝、孢子丝波曲,孢子椭圆形,表面光滑.细胞壁化学组分Ⅰ型.以16 S rDNA序列为基础构建了包括7株相关种属菌在内的系统发育树,111A202与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、微白黄链霉菌(S.albidoflavus)的16 SrDNA序列的相似性达到99.5%和99.6%.根据以上多相分类结果,放线菌111A202的形态培养特征及其细胞组分与链霉菌一致,且与微白黄链霉菌近似性很高,因此,可以将放线菌111A202定名为微白黄链霉菌111A202(S.albidoflavus 111A202).     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

广东茄科雷尔氏菌16S rDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16S rDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%～100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1～12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458～460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

两性生殖卤虫16S rDNA分子系统学研究

[目的]对两性生殖卤虫的分类地位和系统发育情况进行探讨。[方法]测定了中国分布的A.sinicatibetiana、未定名的新疆鲸鱼湖卤虫和青海小柴旦卤虫3种两性生殖卤虫的16SrDNA序列,测序结果与Genbank已发表的另外11个两性生殖种卤虫的16SrDNA序列进行分析比较,并选取丰年虫科Artemiopsisstefanssoni为外群,运用MEGA软件中的NJ法构建分子系统树。[结果]A.persimilis是卤虫属中原始的类群,A.franciscana和A.monica为进化类群,A.urmiana与A.s.sinica以及中国的其它种类有密切的亲缘关系。[结论]基于线粒体16SrDNA序列的两性生殖卤虫系统发育关系为：A.persimilis→A.urmiana、A.sinica和A.tibetiana→A.tunisiana→A.monica→A.Franciscan.     

24株剑麻根际联合固氮菌的16S rDNA序列分析

对海南、广西和广东剑麻主产区种植基地的剑麻根际联合固氮菌进行了分离、纯化及固氮活性测定,获得了24株具有固氮活性的菌株,其固氮酶活性为5.8742～1765.6590 nmol/(mL.h)。16S rDNA序列分析结果表明:参试菌株的16S rDNA扩增区约为1500 bp,无太大的长度变异,其系统发育树表明这24株菌株分别属于6个不同的属。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.