基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。     

日本晚樱花器官特征基因ClAP1的克隆与表达分析

用同源克隆的方法和3′ RACE技术,从日本晚樱（Prunus lannesiana）中克隆得到了1个AP1同源基因ClAP1的cDNA全长。其cDNA全长1 005 bp,包括1个编码238个氨基酸共717 bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,ClAP1是拟南芥的AP1同源基因,其蛋白质的C末端具有一个保守的euAP1模体。半定量RT-PCR分析表明,ClAP1在3个日本晚樱品种‘大岛’、‘一叶’和‘普贤像’的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中均有表达,在叶中不表达,属参与花发育的转录因子,但其表达模式与拟南芥的AP1有一定差别。     

葡萄MADS-box家族基因保守片段的克隆与序列分析

MADS-box转录因子在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。为了从葡萄中克隆出新的MADS-box基因,研究在葡萄花及果实发育中的作用,根据多种植物MADS-box基因保守区序列,设计简并引物,应用RT-PCR技术从红富士葡萄花序中分离出34条MADS-box基因cDNA片段。序列分析表明,这些片段长度在138～152bp之间,包含基因起始密码子。推导的氨基酸序列与已登录的欧洲葡萄及其它物种的MADS-box基因同源性超过83%。用推导的氨基酸序列与已知的欧洲葡萄和拟南芥MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明葡萄中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

杧果MADS-box基因保守区片段的克隆与序列分析

为从杧果中克隆新的MADS-box基因,利用MADS-box转录因子的保守特征设计简并引物,应用RT-PCR从杧果花序中成功分离出14条MADS-box基因cDNA片段。片段长度在138~147bp之间,推导的氨基酸序列与已知的杧果MADS-box基因的同源性为65.2%~82.6%。用推导的氨基酸序列与已知的杧果和拟南芥MADS-box基因进行系统发育分析,可将这些片段归入MADS-box的不同亚家族中。表明杧果花序中存在多种MADS-box转录因子,参与杧果花器官的发育及开花时间的调节。     

八棱海棠肌动蛋白基因(MrACT)的克隆及分析

以八棱海棠(Malus micromalus Makino)为材料,抽取RNA,反转录成cDNA。采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中一种肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16,其编码的氨基酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)actin7编码的氨基酸只有2个氨基酸差别。通过对八棱海棠MrACT基因的表达分析,发现在不同组织中,该基因的表达水平没有明显差异,本文为进一步利用RT-PCR技术,以MrACT基因为内标,研究八棱海棠其他基因的丰度打好基础。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

川乌头F3′5′H基因的cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR结合RACE技术,从川乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)花朵中克隆到1个类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的cDNA全长序列,全长1720bp,包含1个编码506个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H(GenBank登录号:JN635708)。序列分析表明Ac-F3′5′H编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H与其它物种的F3′5′H有很高的序列相似性。以川乌头18SrRNA基因(FJ748878)为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

枇杷果实DHN基因克隆及其在低温胁迫下的表达分析

 以白沙枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）‘宁海白’幼果为试材,通过RT-PCR与RACE扩增,获得两个具有脱水素基因典型结构域特征的cDNA序列。其中DHN1（GenBank登录号：FJ472835）全长639 bp,编码188个氨基酸,属于Y2SK3类型;DHN2（GenBank登录号：FJ472836）全长858 bp,编码273个氨基酸,属于SK3类型。用低温胁迫处理枇杷幼果,–3 ℃处理24 h后电导率明显升高,表明细胞膜开始受到破坏,–6 ℃处理24 h后电导率显著高于–3 ℃处理。半定量RT-PCR和Western-blotting分析结果表明这两个DHN基因在低温胁迫下的枇杷幼果中都上调表达,表明其与枇杷抗低温胁迫有一定关系。     

荔枝漆酶基因LcLac 的克隆与表达分析

 为了探明荔枝漆酶基因LcLac的表达与果皮褐变之间的关系,通过筛选‘妃子笑’荔枝果皮cDNA文库和3′-RACE技术,克隆获得了荔枝LcLac全长cDNA序列（EU 527187.1）。该序列全长1 779 bp,5′-UTR长26 bp,3′-UTR长52 bp,含一个1 701 bp的完整开放阅读框,编码含566个氨基酸残基的多肽。该氨基酸残基序列与欧亚槭树等物种的漆酶蛋白相似性较高。荧光定量PCR结果表明,LcLac在荔枝花中表达量最高,果肉中表达量最低。在采后贮藏前期,随LcLac表达量上升果皮褐变指数升高,且褐变指数较高的‘妃子笑’果皮中LcLac表达量高于褐变指数低的‘紫娘喜’果皮。贮藏中后期严重褐变果皮中LcLac表达量比贮藏前期低。采后贮藏前期果皮中LcLac的上调表达可能对其褐变起促进作用。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。