真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

牙鲆中 Dicer 基因的鉴定与表达

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中克隆了牙鲆Dicer基因序列,该序列全长6 585bp,包括5 691 bp的开放阅读框,编码1 896个氨基酸。在多个物种间的蛋白序列对比中,牙鲆Dicer与其它物种的同源性平均高达78%,与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)同源性最高达到89%;在进化树分析中,牙鲆Dicer与其它鱼类Dicer聚集一支。荧光定量PCR显示,牙鲆Dicer基因在牙鲆大脑里的表达最高。同样的,在牙鲆胚胎和仔鱼早期发育阶段里也发现了相对高水平的Dicer mRNA表达。在用甲状腺激素(TH)处理过程中发现,牙鲆Dicer基因在用TH处理后17 dph的表达最高。本研究预测了牙鲆Dicer在牙鲆发育和变态过程中扮演的重要角色,为进一步阐明Dicer在牙鲆变态发育中的功能奠定了基础。     

牙鲆变态中甲状腺激素调控的靶基因

本研究旨在采用新的方法找出甲状腺激素受体（TRs）介导的甲状腺激素（TH）调控的靶基因。以牙鲆（）为实验样本,表达并纯化了牙鲆p3×Flag-TRαA和p3×Flag-TRβ融合蛋白,采用一种目的基因循环扩增与筛选的方法,寻找TH直接调控的靶基因,最终筛选得到TRαA的候选靶基因11个,TRβ的候选靶基因12个,其中TRαA和TRβ存在4个相同的候选靶基因：）和MYC相关因子X（）。利用荧光定量PCR技术检验了这4个基因在牙鲆不同组织、不同变态发育期以及外源性甲状腺激素和硫脲处理后各个变态发育时期的表达情况,发现在TH含量升高时,靶基因表达量降低;TH含量降低时,靶基因的表达量上升,从而验证靶基因受到TH的负向调控,证实TH在促进牙鲆变态中也存在抑制靶基因转录的情况。本研究旨为研究TH调控牙鲆变态的发育网络提供基础资料。     

牙鲆NR4A1基因在甲状腺素诱导仔鱼变态中的表达调控分析

NR4A1基因是一个重要的转录因子,在信号转导早期通过对靶基因的特异性转录调控发挥着重要的作用。从牙鲆(Paralichthys olivaceus)中克隆了NR4A1基因c DNA序列,检测了其在牙鲆变态中和成鱼各组织中的表达模式,分析了其在外源甲状腺素(TH)以及硫脲(TU)处理仔鱼中的表达变化。结果表明,牙鲆NR4A1 c DNA全长3264 bp,编码568个氨基酸;牙鲆NR4A1基因与其它物种具有很高的同源性,在系统进化树中与鱼类聚为一支;牙鲆NR4A1基因在成鱼心、肌肉和鰓中高表达;在变态过程中,NR4A1水平逐渐升高,且在25 dph达到最高,之后逐渐降低;TH组中的NR4A1基因水平在变态早期和高峰期显著低于正常组,TU组的水平在变态中后期和结束期显著高于正常组;TU组中变态被抑制的仔鱼在正常海水和0.1 mg·L~(-1)TH海水中饲养6 d后,能够顺利变态,且NR4A1基因在拯救组(TU抑制变态仔鱼在正常海水和0.1 mg·L~(-1)TH海水中饲养)中的表达水平与TU对照组相比显著降低,与正常组中同时期的水平一致。结果表明,牙鲆NR4A1基因可能在仔鱼变态调控中扮演着非常重要的角色。     

抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81．8％。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M3-muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal [rpteom S12,GAPDH,COL1A3。在所有22个基因中,COL1A1基因在差减库中的分布频率最高,为22．2％。RT-PCR检测结果表明,在所检测的11个基因中,所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达,只是体现在表达水平上的不同。     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

牙鲆let-7基因的克隆与表达及其靶基因预测

let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用.为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因.利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,...     

褐牙鲆变态期间骨骼发育及其相关基因Sox9,Bmp4和Bmp2的表达分析

褐牙鲆作为一种重要的经济鱼种,有一个特殊的变态发育时期,其间骨骼形态和位置都发生很大改变。本研究利用三重染色技术,对褐牙鲆变态发育时期不同阶段的仔鱼整体骨骼进行染色,并对各阶段仔鱼及部分成鱼组织,采用特异性引物对骨骼发育的相关基因Bmp2,Bmp4和Sox9基因片段进行了克隆和半定量分析。研究表明,随着仔鱼变态发育,部分软骨逐渐转化为硬骨,头部筛骨呈不对称分化,额骨和顶骨位置发生改变,口形态改变,鳃丝软骨成骨,脊椎逐渐发育成熟,随之侧线位置发生改变。Sox9以及Bmp2、Bmp4基因在这时期中存在着差异表达,对骨骼发育有一定的调控作用。成鱼中,Bmp2和Sox9只在鳃、肠道和肝脏中有表达,且鳃中表达量较高。Sox9出膜后表达量突然增加,头部表达量较高,变态发育中开始递减,在变态高峰期明显减少;而Bmp4表达量则是出膜后明显减少,随后在变态高峰期表达量有增加,总体趋势表达量减少。     

miR-124和Otx2在牙鲆变态发育期间的表达调控及其靶向关系验证

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400 bp含有“种子序列”的Otx2 3′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明: pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致;TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32 dph、36 dph时期, pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。     

促卵泡激素对牙鲆尾部神经分泌系统活动的影响

为探究促卵泡激素(FSH)是否参与调控鱼类特有的尾部神经分泌系统(CNSS)活动,实验利用电生理技术检测FSH是否影响dahlgren细胞放电活动.此外,利用PCR技术检测离体的CNSS在FSH急性灌流后和繁殖季节CNSS主要的相关基因的表达.结果 显示,FSH促进dahlgren细胞放电频率和诱导部分细胞静止型放电转...     

达氟沙星在健康和鳗弧菌感染牙鲆体内的药物代谢动力学比较

牙鲆随机分为3组,单剂量静注（健康）和口灌（健康对照和鳗弧菌感染）达氟沙星,进行健康和鳗弧菌感染牙鲆比较药动学和生物利用度的研究。药物浓度用高效液相色谱法测定,数据采用MCP-KP自动化药动学分析程序进行分析。结果表明,健康牙鲆静脉注射达氟沙星(5 mg·kg^-1)后,血药经时过程符合无吸收一室开放模型。口灌给药(10 mg·kg^-1)健康及感染牙鲆的血药浓度与时间关系均符合一级吸收一室开放模型;肝脏和肾脏中药物浓度与时间关系均符合一级吸收二室开放模型。与健康牙鲆药动学参数相比较,达氟沙星在鳗弧菌感染牙鲆中的药时曲线下面积由256.07 mg·h^{-1·L-1降为209.18 mg·h-1·L-1,最大血药浓度由5.699 μg·mL-1降低为2.932 μg·mL-1,消除半衰期由27.758 h延长为46.195 h,生物利用度由71.21%降低为58.17%。}     

饲料中豆粕替代鱼粉比例对牙鲆生长性能及生化指标的影响

以鱼粉和豆粕分别为主要动物性和植物性蛋白源,研究饲料中不同豆粕替代鱼粉比例对牙鲆幼鱼生长性能和生化指标的影响。设计4∶1、3∶1、2∶1和1∶1四种不同动植物蛋白比的等氮等脂饲料配方,按配方制备试验饲料,分别表示为D1、D2、D3和D4。牙鲆幼鱼随机分配到12个设有循环水系统的玻璃钢桶内(900L),每3桶鱼饲喂一种饲料,每天投喂饲料2次,每次达到表观饱食,饲喂期为56d。以增重率(WGR)、饵料系数(FCR)、特定生长率(SGR)、蛋白质效率(PER)、肝体指数(HSI)、肥满度(CF)、鱼体成分和饲料成本为依据,综合评价饲料中不同比例的豆粕替代鱼粉比例对牙鲆的饲养效果。通过测定尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、游离脂肪酸(FFA)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等生化指标,研究饲料中不同豆粕替代鱼粉比例对牙鲆蛋白质代谢和脂肪代谢的影响。随豆粕比例的增加,WGR、PER和SGR逐渐降低,FCR逐渐增加,当饲料中豆粕比例在24%以上时差异显著(P<0.05);HSI逐渐增加,且D1组显著低于其他...     

Effect of arachidonic acid levels in broodstock diet on larval and egg quality of Japanese flounder Paralichthys olivaceus

This study investigated the effect of dietary arachidonic acid (AA) in broodstock of Japanese flounder on subsequent egg and larval quality. Diets with similar proximate composition and n-3 HUFA level, but with different AA levels (0.1%, 0.6% and 1.2% of diet), were fed to the broodstock from 3 months before and during the spawning season. Spawning was observed from March to May. Total egg production over the spawning season was highest in fish fed the 0.6% AA diet and lowest in fish fed the 1.2% AA diet. All parameters measured as egg quality (percentage of buoyant eggs, hatching rate, larval survival and normality of larvae.) were highest in fish fed the 0.6% AA diet. AA content in eggs proportionally increased with the dietary AA level. EPA content of polar lipids of eggs had a negative correlation with the AA level in diets whereas the DHA content was independent of dietary AA. The results of this study indicate that a supplement of AA at 0.6 g/100 g diet improved the reproductive performance of Japanese flounder, but a higher level of AA (1.2 g/100 g diet) negatively affected both egg and larval quality due to a potential inhibitory effect on EPA bioconversion.     

牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析结合Sephacryl S-300凝胶过滤层析及DEAE Sepharose离子层析法,对牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig)进行了分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blotting技术对纯化蛋白的部分特性进行了分析。结果表明,30%、50%饱和硫酸铵分步盐析可以去除牙鲆黏液中除Ig外的很多杂蛋白,得到粗提黏液Ig;再经Sephacryl S-300纯化,Ig纯度较高,其中含有72和26 ku的条带;DEAE Sepharose层析法可进一步纯化Sephacryl S-300柱层析的产物,所提取黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72和26 ku两个条带,初步认为是牙鲆黏液Ig的重链和轻链。Western-blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig单克隆抗体可与黏液Ig重链72 ku条带发生发应。     

不同光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统转录组分析

为发掘日本牙鲆响应光周期变化的重要功能基因,采用新一代高通量测序RNA-seq技术分析8L∶16D、12L∶12D和16L∶8D等3个光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统(caudal neurosecretory system,CNSS)的基因表达变化。转录组测序结果显示,3个样品分别产生了5 807 622、6 147 140和6 116 872个Clean reads。分别对8L∶16D、12L∶12D和16L∶8D条件下的文库进行两两比较,共获得200个差异表达基因。GO分类分析表明,差异表达基因属于生物学过程、细胞定位和分子功能的42个类别。KEGG Pathway显著性富集分析差异表达基因共涉及29条代谢途径,包括糖酵解/糖异生、钙离子信号转导、血管平滑肌收缩和光信号转导等通路。上述结果不仅加深了对鱼类尾部神经分泌系统功能的认识,也为进一步探索硬骨鱼类光信号转导机制提供了多方面多层次的信息。     

IGF-I及其受体基因在牙鲆胚胎发育过程中的表达图式

胰岛素样生长因子-I(insulin-like growth factor I, IGF-I)是脊椎动物生长发育的重要调控因子, 其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-I receptor, IGF-IR)结合而调节。因此, IGF-I及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义。本研究采用荧光实时PCR方法, 以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料, 分析了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式。结果显示, 牙鲆IGF-I、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本, 且各基因的表达在胚胎发育的不同阶段具有明显的发育性变化。IGF-I 基因在早期胚胎发育阶段仅有少量的mRNA存在, 而合子基因的表达在晶体出现至出膜前阶段逐步增加。两种IGF-I 受体基因则展现出迥然不同的表达时序。IGF-IR-1 基因在受精卵、卵裂及囊胚期的早期胚胎发育中有相对较少的转录本, 至原肠期其合子基因强烈表达, 且在神经胚、晶体出现、心跳和出膜前各阶段均有高量的表达; 相反, IGF-IR-2 基因在受精卵至原肠期的早期胚胎中有丰富的转录本, 但合子基因的表达在后期胚胎形成中却相对降低, 暗示了二者可能在调节牙鲆胚胎发育中起着不同的作用。

     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。