抗磺酰脲类除草剂基因用于转基因油菜筛选标记

本研究克隆了来自抗磺酰脲类(SU)除草剂油菜种质M342的ALS基因,并用于油菜遗传转化的筛选标记,成功获得转基因耐除草剂油菜植株。研究发现油菜下胚轴外植体愈伤及不定芽的诱导对除草剂氯磺隆高度敏感,大于5 nm浓度的氯磺隆能完全抑制油菜下胚轴愈伤和不定芽的诱导。在甘蓝型油菜的遗传转化中,筛选剂氯磺隆的有效使用浓度范围比较广,从5～100 nm均可以用来筛选抗性愈伤和抗性芽。用10～20 nm的氯磺隆作筛选剂,具有较高的抗性芽诱导率和转基因阳性率。获得的转基因油菜表现出抗磺酰脲类除草剂的能力并能遗传。     

磺酰脲类除草剂药害规律的研究

采用作物主根长法测定了常用两种磺酰脲类除草剂对玉米（Zea mays L.)农大1236和豌豆（Pisum sativum L.）中碗6号的相对毒力，玉米试验结果表明，以IC50值比较，氯磺隆、胺苯磺隆对玉米的毒力较高，容易造成药害。豌豆试验结果表明，豌豆对氯磺隆和胺苯磺隆比玉米更敏感。离体玉米和豌豆ALS酶的研究表明，豌豆的ALS对两种磺酰脲类除草剂较玉米更敏感，氯磺隆对两种作物的ALS抑制作用也较胺苯磺隆强。     

抗除草剂草丁膦转基因玉米后代筛选方法的研究

Bar基因作为除草剂筛选标记基因具有高效、快速、简便等优点。为高效筛选转基因玉米阳性植株,加快转基因玉米纯合速度和回交转育速度,本试验以郑58自交系及其转基因后代种子为材料,优化了筛选抗草丁膦转基因玉米的方法。研究结果表明,当草丁膦浓度为30mg/L时,利用浇灌的方法可以高效地淘汰大量非转基因植株和Bar基因表达量低的株系或个体。此方法具有筛选效率高、不受环境因素影响等优点,目前已运用此方法,成功地对大量玉米转基因后代进行了筛选。     

Bt基因转化玉米培育抗玉米螟自交系

采用基因枪法将苏云金杆菌(简称Bt)的杀虫毒蛋白基因(CryIA)导入东北春玉米自交系铁7922的幼胚中,诱导愈伤组织.抗虫基因的表达载体是pBI121,包含Bt杀虫毒蛋白基因和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,筛选标记bar由CaMV 35S启动子驱动.通过对后代植株的除草剂草丁膦(PPT)筛选、分子鉴定和ELISA法检测,证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传.对转基因株系进行田间接玉米螟虫卵,调查不同生长时期的危害指数,最终筛选出一批抗玉米螟自交系.     

红色荧光蛋白基因DsRed2植物表达载体的构建及遗传转化

本研究通过简单检测DsRed2基因的表型就能快速筛出含有目的基因的成熟籽粒。DsRed2是一种在激发光下呈红色的荧光蛋白,根据在GenBank中获得的DsRed2及其特异性启动子Ltp2的基因序列,设计特异性引物,并构建筛选标记为Bar基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2,通过农杆菌介导法转入玉米品种郑单958中。经除草剂筛选获得210株抗性植株,PCR检测得到阳性植株80株,对PCR检测呈阳性的植株进行试纸条检测,结果表明红色荧光蛋白基因DsRed2已成功整合到玉米基因组中。通过标记基因的快速检测,从而减少后代筛选的工作量和降低制种成本,为转基因玉米新品种的筛选提供直观有效的筛选标记。     

乙酰乳酸合成酶及ALS基因研究概述

乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂以其独有的优点,20世纪90年代以来一直占领世界除草剂市场。抗草甘膦转基因作物的问世,草甘膦的销售量大幅增加,乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂销量不断减少。然而,大量抗草甘膦杂草的产生,使得人们期望培育出抗不同类型除草剂转基因作物,抗ALS抑制剂类除草剂成为人们的首选。笔者概述了乙酰乳酸合成酶的结构、功能、除草剂作用机理、抗ALS基因的研究现状。期望对抗ALS抑制剂基因的筛选,利用提供参考。     

共转化法剔除转基因小麦中的bar基因

利用PCR检测了268株转小麦黄花叶病病毒复制酶基因T3代植株,初步筛选出只含有功能基因(WYMV-Nib8基因)而不含有筛选标记基因(bar基因)的转基因小麦植株28棵,为转基因小麦的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株     

抗除草剂转基因玉米快速有效鉴定方法的建立

以含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,bar)为筛选标记的抗除草剂转基因玉米为研究材料,通过叶片喷雾法和叶片离体平板培养法试验,建立快速有效鉴定转基因玉米的方法,并探索可有效区分转化和非转化植株的筛选剂剂量。研究结果表明:这两种方法都能快速、有效、方便地鉴定抗除草剂转基因玉米;2000mg/L草铵膦叶片喷雾和培养基中含有5mg/L草铵膦叶片离体培养可快速有效区分是否转入bar基因。通过Bar试纸条分子检测法验证了该鉴定方法的准确性。该鉴定方法的建立为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间和经费。本研究建立的鉴定方法在转基因材料鉴定和转基因安全评估中具有重要意义。     

抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立

本试验建立了一个以除草剂抗性为选择标记的玉米(Zea mays L.)转基因育种中的早期世代批量快速筛选技术.通过对玉米自交系铁7922、吉8902、丹340、PA91以及转Bar基因PA91玉米PA91TBA523在营养钵中浸灌250mg/L、500mg/L、1 000mg/L、1 500mg/L不同浓度的Basta除草剂的萌发试验,确立了不能正常生长的临界浓度:铁7922在250 mg/L的除草剂中无法生长,吉8902在500 mg/L的除草剂中无法生长;转基因材料PA91TBA523在除草剂达到1 500 mg/L仍与不浸灌除草剂的对照无明显差异.利用此方法对花粉管通道法转化获得的转基因T0植株的种子进行鉴定和筛选,从T0植株种子(T1)获得阳性植株6株,3株获得种子,对获得的种子(T2)再做除草剂筛选,抗性植株PCR检测均表现阳性.对以往的转基因T3做批量规模筛选,可以淘汰大量(70%)非转基因和表达不强的株系或个体,减少了田间种植工作量,提高了育种效率.     

农杆菌介导的玉米合子基因转化

本研究建立了农杆菌介导的玉米合子转化方法。用农杆菌介导合子转化方法,以含有bar基因的标准双元载体PTF102和含有bar基因和双价抗虫基因Cry1A（a）或Cry1A（c）、PTA（半夏凝集素）的载体p3300-Bt-pta转化玉米自交系吉8902、丹340、吉4112、吉853、铁7922及PA91,直接从受体植株得到转化种子,用除草剂PPT筛选和PCR鉴定,获得转基因植株及后代。实验分析了2002年、2003年和2004年的3批转化操作的结实率、转化率及转基因的遗传情况：经农杆菌侵染的雌穗平均结实率为39％,合子转化频率达1％以上,转基因可以遗传下去。农杆菌介导玉米合子转化方法可以重复获得成功,表明我们成功建立起一个新的不依赖组织培养的玉米转基因技术体系。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的转化及分子鉴定

为评价玉米ZmPHYA1基因在棉花种质资源改良中的价值,本研究利用农杆菌介导法在陆地棉(Gossypium hirsutum)R15材料中进行了玉米ZmPHYA1基因的遗传转化。经过愈伤组织诱导、抗性愈伤筛选、体细胞分化诱导后获得棉花转基因再生植株。通过田间草铵膦除草剂筛选鉴定抗性植株,并利用PCR扩增其草铵膦抗性基因和目的基因ZmPHYA1进行分子鉴定,发现阳性植株对草铵膦除草剂具较好抗性,并可扩增到256 bp的草铵膦抗性基因和217 bp ZmPHYA1基因的特异条带。进一步通过免疫印迹检测表明,3个不同转基因株系中外源ZmPHYA1基因可正常表达约170 kD大小的蛋白,且在不同组织中该外源蛋白均可正常表达。此外,对转基因植株的不同农艺性状分析表明,转基因株系株高明显低于受体对照,而铃重和纤维长度等性状无明显差异。本研究成功获得具有草铵膦抗性和外源ZmPHYA1基因的棉花新种质材料,为进一步利用光敏色素基因创新种质资源提供了材料来源。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

采用花粉管通道法将蛋白激酶基因导入玉米自交系的研究

通过花粉管通道法将ZmPtil,ZmPtil-1,ZmCIPK2三种蛋白激酶基因植物表达载体分别导入玉米自交系吉444,经草丁膦筛选后得40株抗性植株,通过PCR检测其中28株为PCR阳性植株,平均转化率为1.33％,最后收获11株转基因植株.干旱条件下通过对转基因T1植株的单株籽粒产量、千粒重两个指标进行差异显著性和...     

转Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性

天麻抗真菌蛋白Gastrodianin在体外可以抑制多种病原真菌的生长。为检验转Gastrodianin基因小麦对真菌病害的抗性,采用基因枪法将由ubiquitin启动子驱动的Gastrodianin基因导入小麦品种扬麦158和Alondra, 获得14株纯合的转基因株系。外源基因的PCR检测、染色体荧光原位杂交、半定量RT-PCR分析结果表明,外源Gastrodianin基因在转基因小麦T₅代植株中已经纯合并有不同水平的表达;赤霉病和纹枯病抗性鉴定结果显示,Gastrodianin基因的表达能抑制病原菌在转基因植株中生长,从而减轻病原菌引起的病症发展,且两种病害的减轻程度与Gastrodianin基因的表达水平正相关。     

Rapid and efficient screening of phosphinothricin tolerant oilseed rape (Brassica napus) with a novel germination test

A novel screening test is described for the discrimination of transgenic phosphinothricin tolerant oilseed rape from non transgenic rape seedlings. The method is based on the germination of rape seeds on filter paper soaked with a 0.005% phosphinothricin solution. Under these conditions inhibition of seedling development by the herbicide can be observed after 10 days. The germination test gains an advantage over the routinely used herbicide spraying, because it is rapid, needs little space and allows efficient screening of huge numbers of seeds. The assay has been successfully applied to the screening of different transgenic and non transgenic rapeseed varieties/lines and has been compared to other methods such asBasta® spray test, drop test, ELISA-technique and PCR-amplification of the pat gene. This test allows on one hand large screening programmes to monitor the foreign gene in the environment and on the other quality control of seedlots before market introduction of herbicide tolerant oilseed rape.     

转AtHDG11基因玉米的获得及抗旱性鉴定

培育抗除草剂和抗旱的转基因玉米种质,通过超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法将拟南芥抗旱基因At HDG11导入玉米自交系昌7-2中,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测对获得的转基因植株进行检测,获得5株转基因株系。在此基础上,以非转基因自交系昌7-2为对照,对5个转基因株系进行抗旱性鉴测;对苗期和十叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,测定转基因植株生理活性物质和光合参数。结果表明,在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,MDA含量低于非转基因玉米;不论在正常生长条件下还是干旱条件下,转基因株系的光合速率和水分利用率都明显高于对照植株;而转基因株系的蒸腾速率和气孔导度则明显低于对照植株。综合室内与田间的抗旱检测结果表明,超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法在玉米上是可行的。将拟南芥HDG11基因导入玉米,同样可以有效地提高玉米的抗旱性,为玉米的抗旱育种提供新的种质资源和新的转基因方法。     

荧光素酶作为可视标记整株检测转基因玉米

利用活体成像系统检测转基因玉米中荧光素酶信号整株实时筛选高表达的转基因玉米。结果表明,按照信噪比大于2为高表达转基因阳性植株的标准,获得的T1代66株转pMD35LUC的植株中,11株有荧光信号,其中2株信噪比值大于2;获得的T1代68株转化pMDUBLUC的植株中,30株有荧光信号,6株信噪比值大于2。信噪比值大于2的植株移栽成活7株,经PCR检测均为阳性。2株T1植株的T2代植株无荧光信号值;5株T1植株的T2代植株都有数量不等的植株有荧光信号,其中4株T1株都有信噪比值大于2的T2代植株,经PCR检测均为阳性。本研究跳过一系列大量的操作复杂、耗时、高成本的体外分子检测,直观、准确、实时、低成本地淘汰大量非转基因和表达不强的植株或株系,为玉米转基因植株的筛选提供了有效方法。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。