“家蚕作为生物反应器规模化共表达猪α和γ干扰素及应用研究”项目获浙江省农业农村厅技术进步奖二等奖

正由湖州综合试验站团队成员、湖州市农科院丁农主持,中国农科院生物技术研究所等单位参与实施的"家蚕作为生物反应器规模化共表达猪α和γ干扰素及应用研究"项目获得浙江省农业农村厅2018年度农业技术进步奖二等奖。该项目以α、γ干扰素共表达重组家蚕杆状病毒为载体,研究以家蚕为生物反应器规模化共表达猪α和γ干扰素的高效经济生产模式,解决规模化生产中存在的相关技术问题,并成功将表达产物猪干扰素应用于"机会猪"和仔猪的免疫预防,相关研究为今后应用家     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

猫ω型干扰素在家蚕杆状病毒表达系统的表达及活性检测

将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。     

以蚕蛹生产生物活性物质的操作方法

近年来,随着基因工程和重组技术的发展,家蚕作为生物反应器(家蚕杆状病毒表达载体系统)生产重组生物活性物质的优良特性被生物学家所认识,许多重组生物活性物质通过家蚕这一优良生物反应器得到表达和生产。如中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点实验室用家蚕高效表达了植酸酶基因.用于饲料添加剂,可大幅度减少饲料中无机磷的添加量.提高了料肉比,并减少了磷对环境的排放。又如浙江大学生物化学研究所用家蚕高效表达hGM-CFS制备口服药具有显著的升白细胞功能。     

绵羊γ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及产物的抗病毒活性

干扰素(IFN)具有广谱的抗病毒作用,利用杆状病毒表达系统安全、高效和后加工过程完整的特点,在家蚕体内表达生产重组绵羊γ干扰素(Ovi IFN-γ)。依据家蚕的密码子偏好性对Ovi IFN-γ基因核苷酸序列进行优化和PCR,并克隆了带有His标签编码序列的Ovi IFN-γ基因序列Ovi IFN-His-Tagged-γ,构建分别插入Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ基因的重组病毒。将2种重组病毒感染家蚕5龄幼虫,Western blot检测蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ成功表达。采用细胞病变抑制法测定蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ的效价为1.6×106U/m L,重组Ovi IFN-His-Tagged-γ的效价为2.8×105U/m L,前者的抗病毒活性强于后者,稀释至2.0×104倍时,能够完全抑制VSV-GFP病毒感染。上述结果为利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内高效、安全生产具有抗病毒活性的重组绵羊γ干扰素提供了试验依据。     

鸡干扰素-γ基因的克隆及其重组表达载体的构建

鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)是由鸡体或培养的鸡体细胞在干扰素诱生剂作用下所产生的一类非特异性的功能调节蛋白,具有明显的抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种活性.为了拓展ChIFN-γ的抗病毒图谱,探讨基因工程干扰素在家禽养殖业中的应用前景,研究采用可以同时进行原核和真核表达的pQE trisystem系统进行ChIFN-γ的表达,旨在弥补传统干扰素制备方法的缺陷,为安全、高效制备重组ChIFN-γ奠定基础.     

影响家蚕表达外源基因效率的几个重要因子的比较研究

本研究以重组病毒rSj14NPV为感染病毒,通过比较纯化蛋白的产量,对家蚕作为生物反应器生产基因工 程产品的适宜蚕品种与相关的重组病毒接种技术进行了比较研究。研究结果表明:871×872、秋风×白玉为表达 Sj14的适宜蚕品种;重组病毒接种量与蛋白表达量有关,适宜接种量为4～5μL/蚕;适宜接种时间以5龄2日龄为 优;以家蚕表达外源基因,最好将重组病毒以家蚕细胞复苏后再接种家蚕以保证获得较高的表达效果。     

家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

家蚕丝素重链表达系统表达外源蛋白的应用研究进展

家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力，家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点，利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白，生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用，所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家蚕丝腺生物反应器产生重组蛋白的关键步骤之一。为了构建出更加优良的表达系统，结合国内外研究进展，对家蚕丝素重链表达系统的建立、发展与应用情况进行综述，为该系统的深入研究与应用提供参考。     

家蚕生物反应器的研究概述

家蚕生物反应器在生产活性成分、表达外源基因、改善蚕丝性能等方面,具有很高的开发利用价值。本文概述了家蚕幼虫反应器、家蚕NPV表达系统反应器、转基因家蚕反应器、家蚕丝腺反应器的研究状况。     

猪α+γ共表达干扰素在不同家蚕品种中的表达

本实验拟探索猪α+γ复合型干扰素(IFN-α+γ)共表达重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ)在不同家蚕品种中的表达效率,以期筛选出较适合共表达猪IFN-α+γ的家蚕品种。实验分别对24个原种和7对杂交种共38个家蚕品种的蚕蛹接种重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ),然后利用ELISA方法对猪IFN-α进行表达量检测和比较。结果显示不同家蚕品种对猪α干扰素的表达不同,日系原种的表达量要高于中系原种,且日系×中系杂交种组合普遍高于中系×日系杂交组合。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量ELISA方法的建立

将原核表达重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)以100μg/只剂量免疫8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后进行细胞融合,以昆虫细胞表达重组鸡γ-干扰素为检测抗原,筛选出阳性克隆株,经有限稀释,获得1株稳定分泌抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚型为IgG1型,轻链为Κ链,命名为G1株。Western blot检测显示,该单克隆抗体与原核表达和昆虫细胞表达的rChIFN-γ均具有良好的免疫反应原性。昆虫细胞表达rChIFN-γ经该G1单克隆抗体作用后,失去抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)复制的能力。利用纯化的单克隆抗体和昆虫细胞表达rChIFN-γ建立相对定量ELISA检测方法,取吸光度值(Y)对昆虫细胞表达rChIFN-γ的抗病毒活性单位对数(X)作回归曲线,回归方程为Y=0.1164~*X-0.1281,回归系数R=0.9539,具有艮好的线性关系。     

鸡IFN-γ基因克隆表达及其抗球虫研究进展

鸡干扰素主要由活化的T细胞、NK细胞产生,具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。鸡干扰素-γ基因已经被成功克隆并在Vero细胞和大肠杆菌等表达系统中表达,并且被证明与鸡球虫病的免疫有关,它可激活巨噬细胞,增强K细胞、NK细胞的抗感染作用。另外,ChIFN-γ可用作免疫增强剂,具有广泛的应用前景。     

利用家蚕生物反应器生产基因工程疫苗的研究

本文就家蚕核型多角体病毒BmNPV的生物学特性及其作为表达载体的优点、家蚕生物反应器的原理、生产程序、特点、优化表达策略以及在基因工程疫苗生产中的应用作了较为详细的阐述。     

鸡IFN-γ基因克隆表达及其抗球虫研究进展

鸡干扰素主要由活化的T细胞、NK细胞产生,具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用.鸡干扰素-γ基因已经被成功克隆并在Vero细胞和大肠杆菌等表达系统中表达,并且被证明与鸡球虫病的免疫有关,它可激活巨噬细胞,增强K细胞、NK细胞的抗感染作用.另外,ChIFN-γ可用作免疫增强剂,具有广泛的应用前景.     

提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术

昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。     

鸡γ-干扰素基因的分子克隆与序列测定

应用逆转录 -聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术 ,从 Con A诱导培养 2 4 h的鸡脾淋巴细胞中扩增得到了大小约 50 0 bp的基因 ,将其平端连接到 p UC1 9质粒上 ,进行质粒 PCR和 Eco RI、Hind 双酶切鉴定后 ,筛选阳性重组克隆。序列分析表明 ,该基因阅读开放框架由 4 92个核苷酸组成 ,与马和人γ-干扰素基因序列的同源性分别为 3 5%和 3 2 %,与鸡 型干扰素基因的同源性仅为 1 5%,与国外报道的鸡 γ-干扰素基因序列完全一致。表明鸡脾淋巴细胞受到有丝分裂原刺激后 ,其 γ-干扰素基因 m RNA发生了表达 ,试验成功地克隆得到了鸡 γ-干扰素基因