铜尾矿废弃地耐铜菌株的筛选及其对重金属抗性研究

摘要：通过在固体培养基中加入一定浓度的Cu2+,从铜尾矿废弃地的土样中筛选分离得到一株耐铜菌株。研究结果发现,该菌株最高耐受Cu2+浓度为390 mg?L-1。菌株特性结果表明,该菌株最适生长温度在30℃左右,最适生长pH值为中性,但对渗透压耐受力不是很强。除对Cu2+具有耐性外,该菌对重金属Zn2+、Pb2+也具有较强抗性。     

耐镉、铬丝状真菌菌株的筛选与鉴定

采用梯度浓度驯化方法,从重金属镉、铬污染的稻田土壤中分离、筛选出8株耐铬、镉真菌菌株。5株耐镉浓度为16mmol/L的菌株,4株耐铬浓度为1000mg/L的菌株,其中X29菌株耐镉浓度为16mmol/L,耐铬浓度为1000mg/L。经形态观察、18S rDNA扩增和序列分析,确定了这8株菌株的种属地位分别为：绿僵菌(Metarhizium anisopliae),拟茎点霉(Phomopsis sp.),曲霉（Aspergillus sp.）,木霉（Trichoderma sp.）,尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,青霉（Penicillium sp.）;其中Strain35和Strain55都为青霉,其余6株分别属于不同菌株。本研究不仅为镉、铬污染环境的微生物修复提供了重要菌株,同时也暗示了微生物在重金属降解和修复中有着良好的应用潜力。     

施氏假单胞菌Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA的克隆与表达分析

Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。利 用PCR技术从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA。序列分 析表明,该基因全长1167 bp,编码388 个氨基酸,含有12 个跨膜结构域和保守的功能氨基酸残基位点： Asp-133、Asp-163、Asp-164、His-225、Gly-338。与大肠杆菌nhaA 基因核苷酸和编码氨基酸序列的同源 性分别为99%和99.2%。将该基因与pET-28a 构建成原核表达载体pET-nhaA,转化E.coli BL21,经IPTG 诱导后获得相对分子量约为41 kD的蛋白。平板法和生长曲线法检测表明,重组菌在800 mmol/L NaCl 胁迫下仍能正常生长,耐盐能力显著提高。以上结果证实克隆到的基因是施氏假单胞菌nhaA 基因家族 的成员,具有盐胁迫下将Na+逆向转运至胞外的功能,为进一步利用该基因进行作物耐盐改良奠定了基 础。该基因的GenBank登录号为EU545468。     

贪铜菌6-5双组分信号系统czcR2-czcS2 的克隆

为阐明贪铜菌6-5的耐镉机理,更有效的治理土壤重金属污染。本研究利用同源序列克隆技术从本研究室筛选的高耐镉菌株贪铜菌6-5中成功克隆出双组分信号转导系统czcR2-czcS2,通过DNA测序及序列比对,结果表明,该扩增产物的DNA序列与耐金属贪铜菌CH34中megaplasmid质粒的czcR2和czcS2基因的同源性分别为99%和98%。czcR2-czcS2彼此相邻,并且转录方向一致,很可能作为一个独立的操纵子控制其他功能基因的表达。并利用生物信息学对该调控基因的一般特性、跨膜区和信号肽进行了预测,该研究为开展更为深入的研究以及制定有针对性的重金属污染治理对策建立了基础,具有重要的理论意义和实际应用潜能。

     

一株高耐铜真菌的分离鉴定及其在茶园土壤中

为了筛选并鉴定一株耐铜富铜菌株并用于环境中重金属铜的清除,从有一定圈养时间的生猪养殖场周围土壤中,运用微生物筛选的方法广泛分离筛选耐铜微生物,再反复分离纯化筛选目标菌株,对其进行了形态和分子鉴定,在400倍光学显微镜及扫描电镜下进行形态特征观察,并将基于5.8S rDNA通用引物扩增的测序片段在GenBank数据库中使用BLAST工具进行比对。得到10株不同耐铜浓度的真菌菌株,其中耐性最高的菌株A4,其耐铜浓度达到940 mg/L。A4菌在察氏琼脂培养基上生长迅速,综合确定该菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。菌株A4对茶园土壤中的铜有一定吸附作用。     

水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

过量表达OsCATb提高大肠杆菌对不同重金属逆境胁迫的耐受性

为了进一步研究水稻Catalase b (OsCATb)在重金属逆境胁迫下的作用机制,笔者将外源表达重组质粒pGEX-6p-3-OsCATb转化到大肠杆菌BL21中。SDS-PAGE表明,通过IPTG的诱导表达,在53 kDa的位置获得了与推测分子量大小相一致的可溶性目的蛋白。在1 mmol/L Cd、Zn和Cu的重金属逆境胁迫下,过量表达GST-OsCATb 的重组菌表现出优于对照菌株(BL21)以及过量表达标签蛋白GST的空载体菌株的耐受性;同时,目的基因重组菌体内的过氧化氢酶活性也要远高于实验对照组。研究结果也进一步暗示了水稻OsCATb 作为重要的抗氧化剂,能够参与到细胞的重金属逆境胁迫应答、解毒和耐受机制过程中。     

拮抗细菌GF-312的复合诱变选育

为了提高已筛选出的拮抗菌株的抑菌活性,以荧光假单胞菌(Pseadomonas fluorescens)GF-312为出发菌株,采用紫外线和微波方法对其进行复合诱变,通过对致死率、正突变率和抑菌活性的测定,确定紫外线和微波诱变的最适时间,结合对诱变菌株的传代稳定性测定,获得高效菌株GF-16,其发酵液的抑菌圈直径达到30.4 mm,抗菌活性比紫外诱变之前（自然选育之后）的菌株GF-51提高了18.8%。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP3蛋白的原核表达与纯化

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3.将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础.     

含苏云金芽孢杆菌aiiA基因的重组荧光假单胞菌的构建及对软腐病的抗病活性

aiiA基因编码的AiiA蛋白能降解细菌群体感应系统中的信号分子N_酰基高丝氨酸内酯AHLs,从而减弱致病菌对植物的危害。本文将aiiA基因转入到植物根际促生细菌荧光假单胞菌P303中,构建成防治植物细菌和真菌病害的工程菌P303-ss10。通过PCR和RT-PCR鉴定,均获得0.8 kb的目的片断,表明aiiA基因已经导入P303中。室内平板抑菌试验表明,该工程菌保留了出发菌株对多种植物病原真菌的抑制作用;室内离体试验表明该工程菌对马铃薯软腐病和大白菜软腐病都有一定的抑制作用。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

棉花(Gossypium hirsutum)ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及鉴定

ROP是高等植物里一类分布广泛的信号小G蛋白,在植物生长、发育、抗逆、抗病和激素信号转导过程中起重要调控作用。本研究用PCR体外扩增技术获得棉花GhROP1基因片段,将目的基因与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组,构建诱饵质粒pGBKT7-GhROP1,并成功的转入到Y187酵母菌通过缺陷性培养基培养进行毒性和自激活检测。结果表明,成功克隆棉花GhROP1基因,该基因开放阅读框共有591 bp。双杂交诱饵表达载体pGBKT7-GhROP1构建成功,并成功转化酵母菌Y187;结果显示含表达载体的酵母菌Y187在SD/-Trp平板上长势良好,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。在SD/-Leu,SD/-Trp-Leu,SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上则没有生长,说明转化pGBKT7-GhROP1质粒后的Y187酵母菌无自激活发生。本研究结果为下一步利用酵母杂交系统筛选GhROP1蛋白相互作用的蛋白提供理论参考。     

除草剂抗性基因bar导人烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltrans ferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA。基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株。分别以1.0 kb的叶绿体同源片段trnK-OR     

8种生物农药对温郁金弯孢霉叶枯病病原菌的室内毒力测定

为了筛选出有效防治温郁金弯孢霉叶枯病的药剂,采用菌丝生长速率法测定8 种生物农药对温郁金弯孢霉叶枯病病原菌(Curvularia clavata)的抑菌效果。8 种生物农药对温郁金叶枯病病原菌抑菌效果好的为0.5%氨基寡糖素AS、3%中生菌WP、荧光假单胞杆菌WP和枯草芽孢杆菌WP。毒力最强为荧光假单胞杆菌WP,EC50值为0.93 mg/L;其次为哈茨木霉菌WP、枯草芽孢杆菌WP、0.5%氨基寡糖素AS和3%中生菌素WP,EC50分别为1.30、3.27、6.14、8.42 mg/L。荧光假单胞杆菌、0.5%氨基寡糖素AS、枯草芽孢杆菌和3%中生菌素WP均可有效抑制温郁金叶枯病病原菌的生长,可进一步用于田间试验。     

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。     

RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式(1~4个)整合至大豆基因组中。对T1~T3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T2和T3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37%~18.51%,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。     

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建胸腺肽αl（Thymosin αl,Tαl）基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。