多功能氧化酶系(MFO)与棉铃虫抗药性关系初步研究

本文在增效作用测定基础上 ,研究比较了多功能氧化酶系 (MFO)的三个组分 (细胞色素 P4 50、细胞色素 b5、细胞色素 c还原酶 )在相对敏感棉铃虫 (HDS)与抗氰戊菊酯棉铃虫 (KQR)中的含量、活性及其组织分布规律。增效作用测定结果表明 ,PBO及 SV1对氰戊菊酯具有显著的增效作用 ,增效倍数分别达 2 53.99和71.4 4倍 ;初步表明 MFO在 KQR种群棉铃虫的抗药性中起着重要作用 ;随后的生化研究表明 :KQR种群棉铃虫中肠、脂肪体及体壁的三个组分含量均显著或极显著高于 HDS种群棉铃虫相应部位的含量 ,其中细胞色素 P4 50在上述三个部位中的含量分别是 HDS种群棉铃虫的 1.76、3.12、4 .15倍 ,细胞色素 b5含量分别是HDS种群棉铃虫的 1.57、6 .2 8、2 .39倍 ,细胞色素 c还原酶活性分别是 HDS种群棉铃虫的 1.4 0、1.88、1.6 4倍 ,说明多功能氧化酶系与棉铃虫的抗药性密切相关。     

棉铃虫微粒体多功能氧化酶系组分含量及酶活性在不同生长发育阶段的变化规律研究

细胞色素 P4 50和细胞色素 b5在 KQR和 HDS种群棉铃虫的不同生长发育阶段含量不同 ,但变化规律大致相似 ,均是在 3龄期含量较低 ,从 3龄到 6龄含量上升并达到最高值 ,然后含量逐渐下降 ,直到蛹期达最低值。单加氧酶 MROD和 ECOD在 KQR种群棉铃虫不同生长发育阶段活性大小不同 ,而且变化规律明显不同。从 3龄到 6龄期间 ,MROD活性呈上升趋势 ,并在 6龄期达到最大 ,之后活性逐渐下降 ,在蛹和成虫阶段活性达最小 ;而 ECOD活性在不同生长发育阶段间的差异则不是很大 ,没有明显的阶段表达特异性     

小菜蛾幼虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性与多功能氧化酶的关系

作者就上海梅陇、广州天河和江西莲塘的小菜蛾对拟除虫菊酯的抗药性及其与微粒体多功能氧化酶(MFO)的关系进行了研究。结果表明,上海种群(R)对溴氰菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯的 LD_(50)分别是江西种群(S)的>10414倍、2102倍和245倍。广州种群分别为>10414倍、>3569倍和1533倍。活体增效试验表明,酯酶抑制剂 TBPT 在低剂量(0.208μg/虫)时,对溴氰菊酯和氯菊酯都无增效作用,在高剂量(2.08μg/虫)时分别增效41.7倍和110倍。用 MFO的抑制剂 PB 作同样处理时,低剂量的 PB 对溴氰菊酯和氯菊酯的增效作用分别为5倍和12.9倍;高剂量的 PB 对溴氰菊酯增效562倍以上。~(14)C-氰戊菊酯代谢的离体研究结果表明,R 小菜蛾代谢~(14)C-氰戊菊酯的速度是 S 小菜蛾的2.1倍,TBPT 抑制~(14)C-杀灭菊酯的代谢约20%,而PB 抑制50%以上。由此可以得出结论,MFO 是小菜蛾对拟除虫菊酯的主要机理之一。     

棉铃虫对溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯及其复配剂的抗性趋势与交互抗性

在70％的高选择压下,分别用溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯和凯明2号(50％辛硫磷·甲基对硫磷·三氟氯氰乳油,即含三氟氯氰菊酯的复配药剂)对室内饲养了12代未经农药处理的棉铃虫Helicoverpa armigera(H(?)bner)敏感品系进行了抗性筛选。结果,经连续筛选至第12代的LD_(50)值与筛选前第1代的LD_(50)值比较,抗溴氰菊酯种群对溴氰菊酯的抗性为136.7倍,属高抗水平;抗三氟氯氰菊酯种群对三氟氯氰菊酯的抗性为9.5倍,抗凯明2号种群对凯明2号的抗性为3.4倍,均属低抗水平。用8种常用杀虫剂分别对这3个种群在停止上述杀虫剂筛选2代后进行了交互抗性分析。结果表明,3个种群平均对8种杀虫剂的抗性倍数中,对溴氰菊酯、氰戊菊酯、灭多威的抗性极显著高于其余5种杀虫剂;3个种群的平均抗性倍数之间差异极显著,顺序依次为抗溴氰菊酯种群>抗三氟氯氰菊酯种群>抗凯明2号种群;以平均抗性倍数表示的抗性种群与杀虫剂的交互作用有以下几个结果:①高抗溴氰菊酯的种群对氰戊菊酯和灭多威有极显著的交互抗性,但对三氟氯氰菊酯和凯明2号仍反应敏感。②抗三氟氯氰菊酯和抗凯明2号的2个种群对溴氰菊酯有极显著的交互抗性;抗三氟氯氰菊酯种群对灭多威和氰戊菊酯有一定抗性,抗凯明2号种群对硫丹有一定抗性。     

2-十三烷酮诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera）细胞色素P450 CYP6B6时空表达规律的研究

植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫细胞色素P450 [WTBX]CYP6B[WTBZ]6基因的过量表达,以6龄棉铃虫（[WTBX]Helicoverpa armigera[WTBZ]）幼虫为对象,研究2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用,并对其表达规律进行了初探。分别采用实时荧光定量PCR（qRT PCR）和免疫组化的方法,分析棉铃虫在终浓度为10 mg·g-1 的2-十三烷酮胁迫下,不同时间及不同组织部位[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达变化规律。qRT PCR结果显示：用添加了2-十三烷酮的人工饲料饲喂棉铃虫不同时间后,在头壳中[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 mRNA的表达量一直低于对照组,到48 h时与对照组具有显著差异（[WTBX]t4=15.32,P[WTBZ]=0.000 1）;在脂肪体中随着时间的推移,表达量呈升高趋势,在36 h 已过量表达（[WTBX]t4=7.627,P[WTBZ]=0.001 6）;在24 h时体壁和中肠组织的表达量分别较对照组提高了2.06倍和7.16倍,之后表达量均呈现先降低后升高的趋势,且在48 h时达到最大。免疫组化结果显示：在棉铃虫幼虫组织中发现CYP6B6蛋白在体壁、脂肪体、中肠中均有表达,相比之下在体壁中表达量较高。该研究为深入了解棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定了基础。     

4种杀虫剂对棉铃虫抗药性种群幼虫呼吸代谢的影响

利用 L D50 及 L D95剂量的氰戊菊酯、灭多威、甲基对硫磷和硫丹 4种杀虫剂 ,分别处理棉铃虫 H elicoverp a armigra Hübner敏感和抗药性种群的 5龄幼虫 ,测定各药剂对幼虫呼吸代谢的影响。结果表明 ,以 L D50 计 ,氰戊菊酯和灭多威对抗药性种群的处理剂量分别是敏感种群的 15.8和 14.1倍 ,但其呼吸抑制率却显著降低 ;用甲基对硫磷、硫丹处理 30 0～144 0 min对抗药性种群的呼吸抑制率也低于对敏感种群。在 L D95剂量下 ,用氰戊菊酯、甲基对硫磷处理 10～ 6 0 min对抗性种群呼吸抑制率分别为 14.7%～ 2 7.3%和 2 7.2 %～ 15.5% ,而对敏感种群则分别达 4 2 .0 %～ 4 8.6 %和 4 5.8%～ 50 .4 %。     

聚乙二醇8000对棉铃虫微粒体蛋白沉淀作用的研究

为建立棉铃虫Helicoverpa armigera微粒体P450的分离纯化方案,比较了不同浓度下聚乙二醇8000(PEG8000)对棉铃虫幼虫中肠和脂肪体微粒体蛋白的沉淀作用。结果表明,终浓度为8.0×104 mg/L的PEG8000可以使中肠和脂肪体微粒体蛋白的78%沉淀下来,其中包含的细胞色素P450分别占中肠和脂肪体P450总量的28%和34%。SDS-PAGE显示,中肠微粒体经8.0×104 mg/L的PEG8000沉淀后,被沉淀蛋白的分子质量主要集中在14.1 ~ 40 kD和66 ~97 kD范围内。     

华北棉区棉铃虫对三种杀虫剂的抗性监测

为明确华北棉区棉铃虫Helicoverpa armigera田间种群对3种常用杀虫剂的抗性,于2014—2015年和2018—2019年分别采集河南、河北、山东和山西4个省的棉铃虫田间种群,采用浸叶法于室内测定棉铃虫对辛硫磷、三氟氯氰菊酯和甲维盐的抗性水平。结果表明,各监测点棉铃虫对辛硫磷处于中等水平抗性,在2014—2015年和2018—2019年的抗性倍数分别为13.0~58.5倍和21.1~55.3倍,棉铃虫对辛硫磷的抗性发展相对缓慢;各监测点棉铃虫种群对三氟氯氰菊酯已产生中等至高水平抗性,并呈现逐年上升的趋势,其中河北沧县、河南安阳、山西盐湖种群的抗性倍数由2014年的61.0倍、22.5倍和24.0倍上升至2019年的91.1倍、44.7倍和61.3倍,山东夏津种群的抗性最高,2019年抗性倍数达到216.3倍;棉铃虫种群对甲维盐表现为低至中等水平抗性,河北沧县、河南安阳、山西盐湖和山东夏津种群的抗性倍数分别为8.2~40.4倍、5.8~16.6倍、5.5~23.4倍和11.0~36.6倍。表明4个监测地区的棉铃虫田间种群对3种杀虫剂已经产生了不同程度的抗性,建议减少这3种杀虫剂的使用频次,并注意与其他杀虫剂交替轮换使用,以延缓棉铃虫抗药性的发展。     

棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶的活性分布和发育期变化及植物次生物质的诱导作用

对棉铃虫 Helicoverpa armigera (Hübner)谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）发育期活性进 行了跟踪测定。从卵期开始，GSTs活性呈上升趋势，6龄幼虫达到最高，然后逐渐下降，但化蛹初期仍维持较高水平；用培养基混药法研究发现，芸香苷和2-十三烷酮诱导种群5龄时 活性即达到峰值。6龄幼虫脂肪体GSTs活性最高，中肠次之，头部和表皮最低。用1-氯-2, 4-二硝基苯（CDNB）作底物时，中肠GSTs的 Km值最小。5龄幼虫中肠匀浆液中，GSTs活性90%以上集中在细胞液层，在微粒体、线粒体和细胞碎片层的分布均不超过5%；芸香苷诱 导种群3龄幼虫微粒体层GSTs活性分布明显比对照种群减少，而上清液层则比对照种群 有所增高。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

单对汰选方法在加速抗高效氯氟氰菊酯棉铃虫品系汰选中的应用

通过设计杂合种群单对杂交方式,研究了加速获得抗性品系的方法。以高效氯氟氰菊酯群体汰选后抗性倍数为4.9倍的棉铃虫种群及其同源对照种群为材料,同时设置常规群体汰选方法与单对汰选方法,研究单对汰选方法在加速抗高效氯氟氰菊酯棉铃虫品系汰选中的作用。结果表明,群体汰选两代后抗性倍数由4.9倍提高到7.4倍, 而单对汰选两代后抗性倍数由4.9倍提高到27.3倍。表明在常规群体汰选中穿插几代单对汰选方法可明显加快棉铃虫种群对高效氯氟氰菊酯的抗性汰选进程。     

抗氰戊菊酯棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆及分析

以抗氰戊菊酯棉铃虫六龄幼虫中肠组织总RNA为模板,采用特异性引物,通过对反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的条件进行不断探索和优化,成功克隆出全长为1 557 bp的基因片段(GenBank登录号DQ497428)。该片段包括一个完整的开放阅读框架(1 515 bp)及5'端的42个碱基,编码504个氨基酸残基。与国外报道的细胞色素P450 CYP6B7基因(GenBank登录号AF031468)的核苷酸、氨基酸同源性分别为97.75%和98.81%,为CYP6B7的等位基因。Northern杂交分析表明,抗性品系棉铃虫中肠组织中CYP6B7 mRNA的表达量明显高于敏感品系的,初步表明CYP6B7在棉铃虫对氰戊菊酯的抗药性中起着重要作用。     

转Bt基因棉种植前后3个棉铃虫种群对4种杀虫剂的抗性变化

分别于1990年、1992年、2001年和2005年从山东泰安、山东夏津和湖北天门采集3个棉铃虫H elicoverpa arm igera种群,采用点滴法测定了4种杀虫剂对其的毒力,以监测各种群的抗药性变化趋势。结果表明:19901992年3个种群棉铃虫对氰戊菊酯的抗性增长迅速(13.256.1倍);19922001年抗性增长速度有所减缓(3.111.0倍);20012005年抗性水平降低。3个种群棉铃虫对灭多威和辛硫磷的抗性变化趋势与氰戊菊酯的基本相似,但抗性水平较低;对硫丹则均一直处于敏感水平。引起抗药性变化的原因主要与各类药剂的使用频率和转B t基因抗虫棉的大面积推广有关。     

云南东部稻区白背飞虱种群增殖影响因子分析

为探讨云南省东部稻区白背飞虱种群增殖的主要影响因子,采用正交试验分析了盆栽笼罩条件下白背飞虱种群在虫口密度、接虫时期和水稻品种不同组合条件下增殖倍数。结果表明:(1)接虫时期、接虫密度、品种对白背飞虱种群增殖倍数有极显著的影响,影响作用大小为:接虫时期(F=23.1,P0.001)接虫密度(F=12.8,P0.001)品种(F=5.6,P=0.003);移栽期、拔节期、孕穗期和抽穗期接虫的种群增殖倍数分别为30.1、16.4、8.1和1.3倍,移栽期接虫的种群增殖倍数最高,与拔节期、抽穗期、孕穗期接虫差异极显著(P0.01);5、10、20和40对/丛等4个接虫密度的种群增殖倍数分别为22.1、21.7、7.2、4.9倍,以5对/丛接虫密度的种群增殖倍数最高,与10对/丛处理间差异不显著(P0.05),与20、40对/丛处理间差异极显著(P0.01);品种‘丰优香占’、‘红优7号’、‘云恢290’和‘明两优527’上的种群增殖倍数分别为21.6、15.9、10.8和7.7倍,以‘丰优香占’的种群密度最高,与‘红优7号’间差异不显著(P0.05),与‘云恢290’、‘明两优527’处理间差异极显著(P0.01)。(2)对接虫量、苗龄、田间均温和田间均湿等因素进行多元回归分析,在品种‘红优7号’上,种群增殖模型回归方程为Y=-67.05+1.76 X_1-1.36 X_2+3.70 X_3+0.03 X_4(Y为增殖倍数、X_1为接虫量、X_2为苗龄、X_3为平均气温、X_4为平均湿度,下同)。‘丰优香占’品种的回归方程为Y=-91.65-0.16 X_1-0.38 X_2+3.39 X_3+0.41 X_4。‘云恢290’品种的回归方程为Y=-59.79+0.23 X_1-0.12 X_2+2.28 X_3+0.10 X_4。‘明两优527’品种的回归方程为Y=-8.81+0.27 X_1-0.15 X_2+0.92 X_3+0.01 X_4。在水稻移栽期接虫,接虫密度为5对/丛,品种为‘红优7号’时,白背飞虱的种群增殖倍数为43.3。本研究表明在移栽期至拔节期,较低的成虫密度往往能导致较大的种群增殖。     

棉铃虫对拟除虫菊酯农药的抗性治理效果评价

作者在河北省定州市600hm~2棉田设立了棉铃虫抗药性治理示范区,采取以降低农药的选择压和利用敏感个体的稀释作用为出发点的一系列措施,实施了抗性治理。为评价治理效果,1991～1995年连续监测了河北省3个地区棉铃虫对氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯的抗药性水平。结果表明,在非治理区,固安县种群的抗性指数(RR)由1991年的9.8～15.5倍,上升到1995年的26.1～85.3倍;故城县种群由31.1～57.7倍,上升到90.7～155.4倍;而抗性治理区定州市种群的抗性发展却较缓慢,稳定保持在18.0～25.0倍之间的中抗水平,证明抗性发展得到了有效控制。与非抗性治理区比较,定州棉田棉铃虫的虫口数下降4～8倍、防治费用降低23.7％～50％、纯收入增加约40％,说明抗性综合治理获得了初步的成功。     

北疆地区棉蚜对不同杀虫剂敏感度水平测定

为了解北疆不同地区棉蚜种群对不同类型杀虫剂的敏感度水平,科学指导北疆地区棉蚜的化学防治,利用FAO推荐的叶片浸渍法(1980)测定北疆地区4个棉蚜田间种群对4类杀虫剂的敏感性.结果表明,新农大种群对杀虫剂的敏感水平最高,不同类型杀虫剂的毒力大小顺序为:新烟碱类＞有机磷类＞抗生素类＞拟除虫菊酯类.安宁渠种群较石河子种群更为敏感.石河子垦区内的两个不同种群对菊酯类处于相对敏感状态;对有机磷类产生了明显抗药性,147团种群对辛硫磷的相对抗性倍数为951.8倍,新湖农场种群更达到了1236.9倍;147团种群和新湖种群对啶虫脒亦产生了明显的抗药性,相对抗性倍数分别为134.4倍和270.0倍,但对吡虫啉的敏感度较高.石河子垦区应限制使用新烟碱类的啶虫脒和有机磷类杀虫剂,以减缓棉蚜抗性的发展.     

山东省主要菜区瓜(棉)蚜(Aphis gossypii Glover)抗药性及机理研究

利用毛细管点滴法测定了山东省 4个主要菜区瓜 (棉 )蚜 (Ap his gossypiiGlover)对氰戊菊酯、吡虫啉、氧乐果和灭多威的抗性。结果表明 ,聊城种群对氰戊菊酯的抗性高达 12 1710 .1倍 ,对吡虫啉、氧乐果和灭多威也分别产生了 9.6、2 9.4及 7.9倍的抗性 ;寿光种群对氰戊菊酯的抗性也高达 2 74 59.3倍 ,对吡虫啉、氧乐果和灭多威的抗性分别为 4 .1、18.1及 2 .9倍 ;苍山、泰安两种群对 4种药剂的抗性亦有不同程度的提高。离体酶活性和增效剂测定结果表明 ,聊城种群的抗药性与多功能氧化酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶和乙酰胆碱酯酶活力提高均有关系。     

利用Bt预处理缓解不同龄期棉铃虫的抗药性

用一定剂量的Ｂｔ制剂处理不同种群,不同发育期的棉铃虫、２４ｈ后测定它们对氰戊菊酯的反应。结果表明,不管是抗性种群还是敏感种群,棉铃虫经Ｂｔ预处理后与未处理对照相比,都表现为２－４龄幼虫的敏感性明显提高,而卵,初卵、１龄末幼虫敏感性变化不明显,ＤＥ－Ｒ种群敏感性变化幅度〉９６ＨＮ－Ｒ种群〉ＹＺ－Ｓ种群;以ＹＺ－Ｓ为第三偌线比较９６ＨＮ－Ｒ种群和ＤＥ－Ｒ种群的抗性倍数变化,发现卵和１龄幼虫经Ｂｔ预自理     

马铃薯桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性及其体内羧酸酯酶活性研究

为明确内蒙古马铃薯主要种植区马铃薯桃蚜的抗药性水平及抗性形成机制,采用室内生物测定方法,检测了内蒙古呼和浩特市及呼和浩特武川县马铃薯桃蚜田间种群(分别简称为呼市种群和武川种群)和室内饲养未接触任何药剂的马铃薯桃蚜敏感种群对7种拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,并对供试各种群桃蚜的羧酸酯酶(CarE)活性进行了研究。结果表明:相对于敏感种群,呼市种群和武川种群对氯氰菊酯均产生了高水平抗性(抗性倍数为74.11和549.4);呼市种群对联苯菊酯产生了中等水平抗性(16.03倍),对氰戊菊酯、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯仍保持敏感(1.00~4.00倍);武川种群对溴氰菊酯(10.14倍)、甲氰菊酯(26.46倍)和联苯菊酯(33.74倍)处于中等抗性水平,对高效氯氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯仍较为敏感(50值分别为0.54、1.07和0.93 nmol/L。三唑磷分别与高效氯氰菊酯和溴氰菊酯联用可显著增强其毒力,表明三唑磷与这两种拟除虫菊酯类药剂复配在武川和呼市马铃薯桃蚜防治中具有很好的应用潜力。