E515-A对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的佐剂作用

E515-A是一种含人参茎叶皂苷(GSLS)的白油佐剂。将E515-A和含猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的水相在低剪切力(转速200r·min~(-1))下混合,形成油乳剂疫苗。为观察E515-A对PEDV灭活疫苗的免疫增强作用,将72只ICR小鼠随机分成6组,分别进行2次(间隔2周)皮下注射:(1)0.9%NaCl溶液,(2)PEDV抗原+0.9%NaCl溶液,(3)PEDV抗原+GSLS,(4)PEDV抗原+白油佐剂,(5)PEDV抗原+E515-A和(6)PEDV抗原+氢氧化铝铝胶。于一免后24h采血检测血清IFN-γ水平和NK细胞杀伤活性;于二免后检测血清特异性IgG及IgG1和IgG2a水平,制备脾淋巴细胞检测细胞增殖能力。结果表明,E515-A对于PEDV疫苗诱导的免疫反应具有显著的促进作用,免疫增强效果优于铝胶佐剂。和对照组比较,E515-A油佐剂可以显著促进免疫小鼠的NK细胞杀伤活性,促进细胞因子IFN-γ的产生,增强脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)刺激的增殖应答能力,提高血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平。为增强猪的疫苗免疫效果,E515-A作为猪疫苗的佐剂值得进一步研究。     

猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂的筛选

为筛选猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂,将5种佐剂(聚合物佐剂、矿物油佐剂ISA 201 VG、蜂胶佐剂、弗氏佐剂、铝胶佐剂)分别与3株猪丹毒丝菌株(AEr21、AEr31和AEr32)制备成15种灭活疫苗,经物理性状检验、无菌检验、安全检验合格后分别免疫小鼠,应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)。通过腹腔注射和灌胃2种方式对免疫后小鼠进行攻毒,计算免疫保护率。结果显示,5种佐剂与3株猪丹毒丝菌株制备的灭活疫苗均可刺激小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫,矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组诱导小鼠产生的IgG抗体水平和细胞因子含量最高,与铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05),与聚合物佐剂、蜂胶佐剂疫苗免疫组差异不显著(P>0.05);矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组在攻毒后的免疫保护率最高,对腹腔注射和灌胃攻毒小鼠的免疫保护率分别为80%、80%、60%和100%、100%、80%。试验结果表明,矿物油佐剂ISA 201 VG可作为猪丹毒丝菌灭活疫苗制备的候选免疫佐剂。     

猪链球菌2型灭活疫苗对小鼠的免疫效果评价

在前期筛选出2株毒力强、抗原性好、遗传稳定的猪链球菌2型(SS2)疫苗菌株(HF2、HF3株)并分别制成灭活疫苗(采用ISA 201 VG矿物油佐剂)的基础上,进一步与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株,铝胶佐剂)同步免疫小鼠,利用间接ELISA、流式细胞术、免疫攻毒试验、细菌定植试验和病理组织学观察等方法测定小鼠血清中IgG抗体效价,细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1),外周血中CD4⁺/CD3⁺、CD8⁺/CD3⁺ T细胞亚群含量,攻毒保护率,组织荷菌数和病理组织变化等指标。结果显示,二免7 d后,HF2、HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组的血清IgG抗体效价分别为1:25 600、1:12 800、1:25 600;HF2灭活疫苗组的IL-4、IL-10含量显著高于HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组,IFN-γ、TNF-β含量显著高于HF3灭活疫苗组,但MCP-1含量显著低于HF3灭活疫苗组;HF2和HF3灭活疫苗组的CD4⁺/CD3⁺ T细胞比率均显著低于HA9801商品化灭活疫苗组,但CD8⁺/CD3⁺ T细胞比率差异不显著;HF2、HF3灭活疫苗和HA9801商品化灭活疫苗对小鼠的攻毒保护率均为100%;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、脾脏组织荷菌数显著低于HF3灭活疫苗组;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、肾、脾脏病理变化较HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组轻微。综合结果表明,由SS2(HF2株)制备的ISA 201 VG佐剂灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较强的免疫应答,还可完全抵抗强毒株的攻击。     

免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

为了评价免疫增强剂VA5对猪伪狂犬病毒灭活疫苗的免疫增强作用,将VA5与灭活疫苗混合并制成疫苗。通过常规Bartha-K61株灭活疫苗、含免疫增强剂灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗3组免疫效力对比试验,首次免疫后14和35 d对猪进行采血,并且进行中和实验以及对相关细胞因子进行检测。结果表明,该免疫增强剂能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗血清中抗体产生,同时能显著提高猪外周血淋巴细胞(PBMC)中IL-2和IFN-γ mRNA表达。交叉中和试验表明,VA5能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗对伪狂犬流行变异株的中和作用。试验表明,VA5能够显著提升猪伪狂犬病毒灭活疫苗体液与细胞免疫,为研制免疫效果更好的灭活疫苗提供了依据。     

人参茎叶皂甙对鸭禽流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响

为探讨人参茎叶皂甙(GSLS)对鸭流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响,给鸭群饮水口服GSLS,同时接种禽流感疫苗,通过检测血清抗AIV特异性HI效价、免疫器官指数、淋巴细胞增殖转化指数、细胞因子和肠黏膜SIg A水平,评价GSLS的免疫增强作用;通过测定血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,评价GSLS对机体抗氧化功能的影响。结果表明:在28和35日龄时,饮水口服中剂量GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著高于对照组(P0.05),与1份疫苗组相比,免疫后2、3、4周,饮水口服GSLS能诱导机体对0.75份疫苗抗原产生的HI效价提高,但是差异不显著(P0.05),1份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著提高(P0.05);饮水口服GSLS能显著增强鸭脾脏和法氏囊指数(P0.05),显著提高受Con A刺激产生的脾淋巴细胞增殖转化指数,显著或不显著提高脾淋巴细胞上清中IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)水平,显著提高鸭肠黏膜SIg A含量;饮水口服中剂量GSLS组血清MDA和SOD含量分别显著低于和高于对照组(P0.05)。因此,饮水口服GSLS具有增强鸭群对禽流感疫苗的免疫应答水平和机体抗氧化功能的作用。     

猪流行性腹泻病毒血清IgG间接ELISA检测方法的建立

以大肠杆菌表达系统制备的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原S1D(1μg/mL)每孔100μL进行包被,利用HRP-兔抗猪IgG(1∶20 000)建立了检测猪血清中抗PEDV IgG的间接ELISA方法。阴性判断临界值(M+2SD)为0.632,批内和批间检测的平均变异系数分别为2.3%和3.1%,该方法与商品化的PEDV抗体间接ELISA检测试剂盒同时检测50份临床血清样品,均为阳性,上述结果表明该方法可用于PEDV血清IgG的临床检测。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以乳化灭活的猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为抗原,免疫大白兔,制备兔抗PEDV高免血清,纯化抗PEDV IgG并进行生物素标记。以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原,商品化的PEDV单克隆抗体作为捕获抗体,生物素标记的IgG作为检测抗体,建立了检测PEDV的生物素-亲和素系统的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法最低检测限量为20 ng/μL,且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行检测,3份检出PEDV阳性,与RT-PCR法的符合率为100%。本研究为PEDV临床检测提供了新方法,也为猪腹泻病原的多重检测技术研究奠定了基础。     

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL^-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV 亚单位疫苗提供了参考。     

桑杜口服液增强猪蓝耳疫苗免疫效果

拟考察桑杜口服液对猪蓝耳疫苗的免疫效果。选择100头健康仔猪,平均分为桑杜口服液高、中、低剂量组,免疫对照组和空白对照组。33日龄首次免疫接种猪蓝耳疫苗,1个月后进行二免,每次免疫前3 d灌胃桑杜口服液,每天1次,连用7 d。分别于首免后7、14、21、28 d采血,测定血清中猪蓝耳病特异性抗体水平,以及首免后7、14、21 d血清IL-2、IFN-γ、IgG含量,并于30日龄和60日龄时称体质量,比较各组指标的变化。结果表明,桑杜口服液高、中剂量组在首免后大部分时间均能显著提高血清中猪蓝耳病特异性抗体水平与血清IL-2、IFN-γ、IgG含量,并且中剂量组具有显著的促生长作用。表明桑杜口服液高、中剂量口服给药可显著提高猪蓝耳病疫苗免疫效果,可开发为中药免疫增强剂。     

不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较

以不同材料为佐剂制备坦布苏病毒灭活疫苗,用ELISA方法检测免疫鸡不同时间抗体产生的情况,以选择最佳制苗佐剂。取40只1月龄SPF鸡,随机分成8组,以不同的佐剂组合制备疫苗,免疫7个组(包括白油组、白油+IL-2组、铝胶组、铝胶+IL-2组、蜂胶组、蜂胶+IL-2组、IL-2组),另设不免疫对照1个组,分别于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血,用已建立的ELISA方法检测血清中的ELISA抗体,比较不同佐剂灭活疫苗的免疫效果。结果表明:以白油+IL-2作为佐剂组的灭活疫苗效果最好,产生的抗体水平优于其他各组,免疫后3周ELISA抗体可达到1∶800以上,是较理想的制备坦布苏病毒灭活疫苗的佐剂。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。     

大豆抗原蛋白对仔猪的免疫作用

通过口服或注射两种免疫途径研究大豆抗原蛋白免疫剂对仔猪血清中大豆抗原蛋白抗体效价及IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平的影响。选取70头7日龄“杜×长×大”杂交仔猪,随机分成A组(对照)、B组[β-伴大豆球蛋白(7S)致敏]、C组[大豆球蛋白(11S)致敏]、D组(7S口服免疫+致敏)、E组(11S口服免疫+致敏)、F组(7S注射免疫+致敏)和G组(11S注射免疫+致敏),每组10头。D、F组和E、G组仔猪在7日龄时按分组设计,口服或注射纯化的11S或7S免疫剂,A组注射生理盐水;在14日龄时再免疫一次。所有仔猪于21日龄断奶。从21日龄开始,A组仔猪饲喂基础日粮,B、D、F组和C、E、G组仔猪饲喂分别添加5% 7S或5% 11S的基础日粮,连续饲喂7 d。在27日龄时,对仔猪进行皮肤致敏试验。在 7、14、21、27日龄时,所有仔猪前腔静脉采血,采用ELISA法检测血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平,采用琼脂扩散法测定血清中7S和11S的抗体效价。结果显示,仔猪皮肤致敏评判结果B、C组>D、E组>A、F、G组,且7S致敏性高于11S。在21日龄时,F、G组血清中抗体效价高于D、E组;在27日龄时,B、C组血清中抗体效价高于D、E、F、G组。在14日龄时,F组与A组相比,IgG、IL-4水平显著(P<0.05)升高;在21日龄时,D、E、F、G组的IgM、IgE、IgG、IL-4水平与A、B、C组相比显著(P<0.05)升高,除了G组IgG外,F、G组又显著(P<0.05)高于D、E组;在27日龄时,各处理组IgE、IgG和IL-4水平极显著(P<0.01)高于A组,且B组显著(P<0.05)高于C组,D、E组显著(P<0.05)高于F、G组。试验结果证实,7S对仔猪的致敏作用高于11S,大豆抗原蛋白免疫剂对仔猪具有一定的免疫保护作用,且对7S的免疫效果优于11S,注射免疫的效果要优于相同剂量的口服免疫。     

新城疫分离株与La Sota疫苗交叉免疫保护性研究

用新城疫(ND)分离强毒油佐剂灭活苗和NDV La Sota油佐剂灭活苗分别免疫带有新城疫母源抗体的雏鸡,免疫后每7d采集血清,用微量血凝抑制试验方法检测HI抗体.并于免疫后第21、28、35 d用鸡新城疫分离毒和NDV F_(48)E_9分别进行攻毒试验,结果显示,免疫鸡的HI抗体水平没有大的差异,分离毒株灭活苗对鸡新城疫强毒感染的免疫保护效力优于La Sota灭活苗.     

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒三联苗免疫试验

本研究采用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒细胞培养物制备了三联灭活疫苗,实验室免疫结果表明,肉猪和妊娠母猪免疫后15d达到较高的免疫水平,免疫有效期超过6个月。妊娠母猪所产仔猪可获得高水平的被动免疫保护。试验场应用结果表明母猪保护率达98％,仔猪被动免疫保护达93％。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫对鸭消化道抗体分泌细胞的影响

为探讨鸭源禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫雏鸭的效果,应用鸭源禽流感灭活抗原与复合黏膜免疫佐剂(CpG和/或葡萄糖)饮水免疫雏鸭,检测消化道(主要是咽和小肠)抗体分泌细胞的变化。首先分别从鸭的胆汁和血清中粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,经纯化后制备了兔抗鸭IgA和IgG,然后应用免疫组化技术显示鸭消化道IgA和IgG分泌细胞。试验结果表明:用禽流感灭活抗原配合CpG和/或葡萄糖饮水免疫后3、5和7周,消化道黏膜局部IgA分泌细胞面积均显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌细胞(除首免后第3和7周小肠外)极显著升高(P<0.01)。而单独用禽流感灭活抗原和用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫对消化道局部免疫水平影响不大。结论:鸭源禽流感灭活抗原配合免疫佐剂饮水免疫能够提高雏鸭消化道局部免疫水平。     

鸡大肠杆菌多价复合佐剂灭活苗的研制

鸡大肠杆菌多价复合佐剂灭活苗是采用山西省优势鸡致病性大肠杆菌的菌体碎片作为抗原物质,矿物油和黄芪多糖组成复合免疫增效佐剂研制而成的。通过免疫效果试验、免疫保护期试验及疫苗保存期试验等,结果表明,免疫后7 d,该疫苗即可产生坚强的免疫力,而常规疫苗(对照Ⅱ组)则需14 d;血清抗体滴度于接种后约6周时,O78达到1∶32(最高可达1∶53),并且维持6周以上,而常规疫苗的最高值为1∶18;该疫苗的免疫保护期为5个多月,常规疫苗为4个月;4～8℃贮藏,保存期不低于14个月。实验室和区域试验结果说明该疫苗具有产生循环抗体时间早、安全、免疫保护率高等特点。