向日葵黄萎病病原菌轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法

为建立可同时快速检测引起向日葵黄萎病害的2种检疫性病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.和黑白轮枝菌V.albo-atrum Reinke et Berthold的方法,根据2种病原菌的β-tubulin基因分别设计特异性DPO引物,建立多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅大丽轮枝菌和黑白轮枝菌可分别扩增出225 bp与151 bp的特异性条带,其它向日葵病害的7种病原菌及阴性对照均无目的条带;反应体系中引物终浓度为0.2μmol/L、退火温度为60℃时,30个扩增循环的检测灵敏度均可达0.05 ng菌丝DNA量;在45~65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段,表明该方法退火温度范围宽。所建立的检测方法能够准确、高效地检测引起向日葵黄萎病的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌,可用于向日葵种子带菌筛查及田间病害诊断检测。     

向日葵黄萎病菌突变体库的建立及其阳性转化子的鉴定

为揭示向日葵大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.的致病机理,利用农杆菌介导法将带有潮霉素抗性标记和绿色荧光蛋白报告基因的双元载体转入大丽轮枝菌的分生孢子中并获得阳性转化子,以野生型菌株为对照,对随机挑取的阳性转化子的菌落形态、菌丝生长速率、产孢量、粗毒素分泌量和致病力进行了研究。结果表明,共获得800株阳性转化子,随机选取的40株阳性转化子中有2株的菌落只产生白色气生菌丝,不能形成黑色微菌核。与对照相比,40株转化子的生长速率均有不同程度降低,其中转化子A1生长速度降低最显著,菌落直径仅为3.28 cm,比对照下降了38.92%。40株转化子中有3株的产孢量高于对照,其中转化子A9的产孢量最高,为3.50×10~7个/mL,比对照提高1.10倍;转化子A1的产孢量最低,仅为1.35×10~7个/mL,比对照下降了19.16%。40株转化子中有4株的粗毒素分泌量较对照显著升高,占测定菌株的10%,有24株较对照显著降低,占60%,其余12株与对照无显著差异。40株转化子中有3株的致病力较对照显著增强,占测定菌株的7.5%;有7株的致病力较对照显著降低,占17.5%;其余30株与对照无显著差异。     

堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究

为了明确菌糠堆肥提取液的生物防治效果,进一步探讨其抑菌防病机理,以便于有针对性地利用堆肥提取液达到防病、治病的效果。采用体内和体外2种试验方法,以草莓黄萎病菌为靶标病原菌,研究了堆肥提取液原液、高温灭菌液和过滤除菌液对大丽轮枝菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用,通过温室盆栽试验验证其对草莓黄萎病的防病促生效果,并测定根施堆肥提取液对草莓叶片内防御酶系的影响。研究表明,堆肥提取液对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用,抑制率分别为92.43%和82.94%,经高温灭菌和过滤除菌后抑制效果显著降低。盆栽试验结果表明,预先用堆肥提取液灌根处理对草莓黄萎病的防治效果高达42.23%,且能诱导草莓叶片内防御酶活性显著增强,接病原菌后第6 d该处理下的POD和PPO活性分别比施清水对照提高了45.45%和39.47%,而MDA含量则下降了14.83%。说明微生物对病原菌的直接抑制作用以及诱导系统抗性是菌糠堆肥提取液发挥抑菌防病功效的主要因素。     

番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体的筛选与应用

为防治番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)在我国葫芦科作物上引起的病毒病害,以PRSV西瓜株系山东分离物(PRSV-SD)侵染性cDNA克隆为基础,采用定点突变方法将辅助成分-蛋白酶保守氨基酸137位和346位的天冬酰胺(N)和417位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A),应用农杆菌浸润法接种西葫芦叶片并分析突变对PRSV-SD致病力的影响,筛选弱毒突变体,进而评价其交叉保护效果。结果表明,与野生型PRSV-SD相比,获得的3个突变体N137A、N346A和V417A,接种后在西葫芦植株上的症状明显减轻,衣壳蛋白在叶片中的积累水平分别为野生型PRSV-SD的24.0%、13.0%和4.0%,均为弱毒突变体。当保护间隔期为10 d时,弱毒突变体N137A具有完全的交叉保护效果,N346A可延迟发病15 d,而V417A无交叉保护效果。当间隔保护期为15 d时,弱毒突变体N137A和N346A的保护效率分别为100.0%和26.7%,而V417A无交叉保护效果。     

分离土壤棉花黄萎病菌选择性培养基的筛选

 采用土壤检测稀释法、水筛法和不同土样接种量,对5种土壤浸提液改良培养基进行了比较研究。结果表明,土壤水筛法对土壤棉花黄萎病菌的检测效果优于稀释法,其菌落检测数增加4~10倍。培养基每皿0.25 g土样接种量的检测效果高于0.5 g和1g。5种测试培养基中,培养基D对分离土壤棉花黄萎病菌的选择性表现最好,其土壤接种体检测回收率达63.5%~83.3%.培养基D的组份为:土壤浸提液25 ml,KH₂PO₄ 1.5 g,K₂HPO₄ 4 g,尿酸钠0.2 g,半乳糖醛酸钠(果胶)1g,山梨糖1g,Dox盐2 ml,Tergitol NP-101ml,PCNB0.1g,琼脂17g,蒸馏水1000 ml,pH6.4~6.7。每1000ml融化培养基倒皿前加抗菌素液50 ml (含氯霉素0.05 g,链霉素0.05 g,青霉素-G盐0.05 g)。     

诱导棉花抗黄萎病的研究(2)尖孢镰刀菌的诱抗作用

 从不同作物上获得的16个尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)分离物,用棉苗进行致萎力和致病力检测后,选出萎蔫指数和病情指数相对较低的F_86-15、F_86-12、Fa三个分离物分别诱导棉花对黄萎病(Verticillium wilt)的抗病性,以F_86-15效果最好。测试结果表明,棉株经过尖孢镰刀菌诱导的,其根部类萜烯醛类物质含量比未诱导的均有不同程度的增加。用孢子萌芽法鉴定该物质的抑菌活性,证实对棉花黄萎病菌分生孢子萌发有抑制作用。     

拮抗茄子黄萎病菌土壤放线菌的分离筛选和鉴定

为了研究土壤拮抗性放线菌对茄子黄萎病的生防价值,从陕西省延安市宝塔区与汉中地区土壤中分离、纯化获得154株具有纤维素降解活性的放线菌。采用平板对峙培养法进行初筛,用生长速率法对抑菌效果较好的菌株ZX-10-4进行抑菌谱的测定,并进行盆栽试验验证其对茄子黄萎病的防治效果,通过形态、培养特征及16S rDNA序列分析研究其分类地位。结果显示,有17株放线菌对茄子黄萎病菌抑菌效果较好且抑菌活性稳定,其中菌株ZX-10-4的抑菌活性最高,抑菌率达90.15%;活性菌株ZX-10-4发酵原液对茄子黄萎病的保护和治疗作用分别为70.00%和60.33%,稀释5倍液的防效也在50%以上。根据形态、培养特征、生理生化指标和16S rDNA序列分析,初步确定菌株ZX-10-4为白网链霉菌Streptomyces albireticuli的近似种。     

内生菌对棉花黄萎病病菌及毒素的抑制作用和对棉花的促生作用

 棉花黄萎病是土传病害,缺乏有效的药剂防治。     

向日葵菌核病生防菌株的筛选及防效分析

为了从内生菌资源中筛选出对向日葵菌核病有防效的生防菌株,本研究从12个向日葵品种籽粒中分离获得不同菌落形态的33株内生菌株,在此基础上,利用纸杯法进行初筛,从中选出两株对菌核病具有良好防效的菌株,进而采用离体叶片接种试验进行复筛,筛选出一株对菌核病离体防效达100%的内生菌菌株KB3(Bacillus subtilis)。温室盆栽条件下KB3能够显著降低向日葵苗期菌核病的病情指数,防治效果达79.47%。含菌培养基接菌试验表明菌株KB3发酵滤液对核盘菌的抑菌率为68.46%,分皿试验发现KB3能够抑制核盘菌黑色菌核的形成。通过全基因组测序,分析预测到KB3中有7个次级代谢产物合成基因簇。本研究所采取的纸杯法和离体叶片接种相结合的筛菌方法将对菌核病生防菌株的筛选具有参考意义,所获KB3菌株对于向日葵菌核病的防治具有一定的应用前景。     

嫁接茄子根系分泌物对黄萎病菌的化感作用

研究了不同砧木、不同浓度嫁接茄子根系分泌物对茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae）孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,与自根茄相比,所有参试的嫁接茄根系分泌物都不同程度抑制了黄萎病菌孢子萌发和菌丝生长;并且随着根系分泌物浓度的增加,抑制作用增强。     

4株拮抗细菌对棉花黄萎病的防治效果及机制

棉花黄萎病严重制约新疆棉花持续高产和稳产,拮抗细菌在棉花黄萎病生物防治中潜力巨大。本研究旨在明确4株拮抗细菌对棉花黄萎病的防治效果及其机制,为棉花黄萎病的生物防治提供理论依据。本文采用共培养法,研究4株拮抗细菌对黄萎病菌分生孢子浓度、菌丝和孢子形态、膜透性和产毒素能力的影响,采用滤液接种法进行盆栽试验验证其对棉花黄萎病的防治效果,采用愈创木酚法和氮蓝四唑光化还原法测定棉株体内防御酶系的活性。结果表明,4株拮抗细菌能够减少黄萎病菌分生孢子浓度,破坏其细胞形态,导致其细胞膜破裂,降低其毒蛋白浓度。接种4株拮抗细菌,能够诱导棉株体内POD酶和SOD酶等防御酶系的积累,提高了棉花的抗病能力,由菌株SHZ-24、SHT-15、SMT-24和BHZ-29处理的棉花,其对棉花黄萎病的最高防治效果分别为73.82%、80.48%、84.91%和84.18%。4株拮抗细菌通过抑制黄萎病菌的生长和诱导植物产生防御反应来提高对棉花黄萎病的抗性,其对棉花黄萎病具有良好的防治效果。     

甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果及定殖能力

为了探明甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的防治效果及其定殖能力,本文利用盆栽接种试验研究了菌株AL7对棉花黄萎病的防治效果;将带四环素抗性的pGFP78质粒转入到菌株AL7中,分析了菌株AL7在棉花根围土壤中、根部组织内的定殖情况。结果表明,菌株AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果为77.1%。pGFP78质粒转入后对菌株AL7的生长没有明显影响,仍具有游动性和产生物膜。定殖检测结果表明,菌株AL7能够在棉花根围土壤中及根系组织内长期定殖,接种5 d时定殖数量最高,达6×10~6cfu/g土,接种80 d后根围土壤中的定殖数量仍维持在2×10~6 cfu/g,根系组织内的定殖量为6×10~4 cfu/g。利用激光共聚焦显微镜观察验证,接种7 d后菌株AL7已经进入到棉花根部的中柱鞘细胞,能够在棉花根内大量定殖。     

江西棉黄萎病发生及防治

江西棉黄萎病1996年传入,至目前发生的均为非落叶型弱致病菌系,其发生规律及危害趋势与枯萎病基本相同,损失率一般在10％-30％。防治上宜选育和推广抗病品种及其他防治措施应急。     

棉花黄萎病、枯萎病拮抗细菌的筛选及其生长特性的研究

从广西大学、中国农业科学院植物保护研究所黄萎病、枯萎病发病较轻的试验棉田根围土中筛选出5株拮抗性能较高的细菌,其中一株S6经过16s rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌。经过测定,S6的最适生长温度为28℃,最适pH为7,对NaCl的耐受达到10%。     

西兰花植株残体还田对棉花黄萎病的防治效果及其安全性评价

本研究探讨了温室和田间试验条件下西兰花植株残体还田对棉花黄萎病的防治效果以及西兰花残体对棉花生长的安全性,以期为深入研究西兰花植株残体对棉花黄萎病的生态防治机制提供依据。将粉碎的西兰花植株残体与培养基质分别按1%、3%、5%、7%和14%处理混匀,在（28±2）℃条件下分别腐解7和30 d后种植棉花,测定其对棉花出苗率、株高的影响以及对黄萎病的防治效果。研究结果表明,当腐解时间为7 d,西兰花残体处理比例为1%和3%时,棉花出苗率与不添加西兰花残体的空白对照处理不存在显著差异,但对株高具有显著促生长作用,增幅分别为19.46%、42.41%和36.96%;西兰花残体添加比例为5%、7%和14%时,对出苗具有不同程度的抑制作用。当腐解时间为30 d时,上述各比例西兰花残体处理后的棉花出苗率和株高与空白对照之间差异不显著。西兰花残体处理显著降低了棉花黄萎病的发病率和病情指数,其21 d后的防治效果达到72.55%。田间试验表明,西兰花残体在棉花全生育期内对黄萎病的防治效果为43.06%。综合分析表明,西兰花残体的施入,促进了棉花生长,降低了黄萎病的发病率和病情指数,且在发病初期的防治效果优于后期。研究结果为深入研究西兰花残体防治棉花黄萎病的生态机制提供理论依据和技术指导,最终为棉花黄萎病的绿色防控和化学农药的减量提供了新途径和思路。     

棉花黄萎病拮抗细菌筛选与B-101菌株抗菌蛋白分离

 The antifungal proteins of antagonistic strains NCD-2, B-101, DHT-13, BDT-25, JJ-134, JJ-102 and 80b-2 isolated from the soil infected with Verticillium dahliae were obtained from their fermentation fil-trates through precipitation with 75% ammonium sulfate salting out. Antagonistic activities of the proteins were determined via cylinder-plate method. Results indicated that antifungal proteins from 80b-2, NCD-2, DHT-13 and B-101 had higher specific activity, of which B-101 and NCD-2 could produce clear inhibition zone. Antifungal protein of B-101 strain was obtained by using the salt fractionation. It was found that protein precipitated with 20%-30% saturation ammonium sulfate could produce transparent and bigger inhibition zone, thus it had obvious antifungal activity. Furthermore the antifungal protein was separated by DEAE-cellulose chromatography. An antifungal protein fraction named RFP-6 was obtained, which showed definite inhibition activity against Verticillium dahliae. Its molecular weight was approximately 14.4 kD as determined with SDS-PAGE.     

北疆棉花黄萎病发病率调查及土壤中黄萎病菌微菌核数量与种群类型分析

为了解北疆棉花黄萎病的发生情况及发病与土壤中黄萎病菌微菌核数量的关系和病原菌种群类型, 2021年对北疆石河子?奎屯?博乐等8市(县)棉田棉花黄萎病发病率?土壤中黄萎病菌的微菌核数量?菌株种群类型进行了抽样调查?结果表明, 北疆未发生棉花黄萎病的棉田占49.2%, 0%<发病率<5.0%的棉田占32.7%, 发病率≥5.0%的棉田占18%?与2013年?2015年相比, 2021年无病田率分别增加17.7和12.7百分点, 发病率≥5%的棉田分别减少15.7和21.6百分点?从棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的关系来看, 整体上北疆棉田棉花黄萎病发病率与微菌核数量相关性不显著(r=0.119 1); 分区域看, 石河子-沙湾片区?奎屯-乌苏片区?精河-博乐片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数分别为0.033 2?0.007 6?0.062 3, 均无显著相关性; 而呼图壁-玛纳斯片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数为0.635 7, 呈中度正相关?土壤中的黄萎病菌菌株以菌核型为主, 占57.9%, 菌丝型占23.2%, 中间型占18.9%?用特异性引物进行PCR检测表明, 土壤中黄萎病菌落叶型菌株占97.6%, 占绝对优势?本研究将为北疆棉区棉花黄萎病的综合防控提供理论依据?     

马铃薯枯萎病生防芽胞杆菌筛选及生防效果研究

马铃薯枯萎病是马铃薯主要土传真菌病害之一,已成为限制我国马铃薯产业健康发展的重要因素之一。菌株ZF128是本实验室从马铃薯根际土壤分离筛选得到的一株对马铃薯枯萎病菌具有显著抑制效果的生防细菌。经生理生化、BIOLOG GENIII和系统发育树分析,鉴定菌株ZF128为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。抑菌谱测定结果显示,ZF128对5种病原真菌和5种病原细菌都具有显著拮抗效果。光学显微观察发现,菌株ZF128处理的病原菌菌丝生长受到抑制并出现膨胀变粗现象。发酵试验表明,菌株ZF128在甘露醇培养基中发酵上清液对马铃薯枯萎病菌的抑制效果最好。盆栽试验结果证明,接种菌株ZF128后马铃薯发病明显减轻,防效为82.46%。此外,定殖和促生试验表明,菌株ZF128能在马铃薯根际和根部有效定殖30d以上,处理组马铃薯株高、根长、地上部和地下部鲜重及叶绿素含量等指标均显著高于对照组。综上,菌株ZF128生防性状优良,是一株具有潜在应用价值的芽胞杆菌。     

棉花抗黄萎病品种选育方法探讨

 在棉花抗病育种中,通过病圃或重病地选择抗病单株是常规的选育方法,但其在抗黄萎病育种中的效果并不理想。如何提高抗黄萎病育种效率,促进育种进程是目前急需解决的问题之一。为此,19982002年我们在北京人工病圃,对不同抗病杂交组合和选育方法的选育效果进行了研究。结果表明,在双亲本均为抗(耐)品种的杂交后代群体中,以9月中旬是抗病还是感病并没有多少关联,对黄萎病抗性的选育应选群体抗病性强的株系或组合,以其丰产性为主要选育目标;只有抗与抗(或高耐)的组合中才能选出黄萎病抗性更高的株系;在抗(耐)品种中,后期无论是抗或感的单株其后代的抗病性差异不明显