棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

粘虫脂动激素基因MsepAKH1的克隆与成虫期表达模式分析

为明确脂动激素基因AKH在粘虫Mythimna separata(Walker)能源代谢过程中的作用,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术测定该基因在成虫期的组织与发育阶段表达模式。结果表明,粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA序列全长为449 bp,GenBank登录号为KP979739.1,开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸,具有昆虫脂动激素基因家族典型的结构特征;预测该基因编码的MsepAKH1蛋白分子量为7.61 kD,等电点为8.46,MsepAKH1的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta、二化螟Chilo suppressalis、小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、家蚕Bombyx mori的AKH氨基酸序列同源性较高。MsepAKH1基因在粘虫初羽化雌蛾不同组织间的表达量差异显著,主要在头部和飞行肌内表达,分别约为同日龄雌蛾脂肪体内表达量的15.4倍与8.1倍,在脂肪体、卵巢与中肠内的表达量显著降低。对不同日龄雌蛾头部和飞行肌内的表达量检测发现,在7日龄雌蛾头部和3日龄雌蛾飞行肌内的表达量分别显著高于其它日龄雌蛾相同组织中的表达量,分别约为初羽化雌蛾相同组织表达量的2.4倍与1.6倍。表明MsepAKH1基因的表达因粘虫雌蛾组织与日龄间的不同而呈现动态变化。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

黏虫保幼激素环氧水解酶基因MsJHEH2的克隆与生物学功能

保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH）是调控保幼激素（juvenile hormone,JH）滴度的重要降解酶。本文在黏虫体内克隆得到一条具有EHN环氧水解酶超家族结构域的保幼激素环氧水解酶MsJHEH2基因cDNA序列（GenBank登录号：MT802192）,长度1533 bp,开放阅读框（ORF）为1389 bp,编码462个氨基酸,推测分子量和等电点分别为52.42 kDa和7.07。表达模式分析发现,MsJHEH2在黏虫各个龄期与组织中均有表达,其中在蛹期和中肠中表达量最高。RNA干扰处理4龄幼虫6 h后的基因沉默效率最高,为64.86%,此时黏虫体内JH滴度上升为对照的1.58倍。该基因沉默后对黏虫无明显致死作用,但导致其蛹历期延长、羽化率降低。本研究表明MsJHEH2可以通过调节JH含量进而影响黏虫生长发育进程。     

褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析

为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1（GenBank No.：ALE32751）和NlPPO2（GenBank No.：ALE32752）全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

不同温度对大豆蚜海藻糖合成酶基因表达及沉默效率研究

海藻糖是昆虫血淋巴中最重要的糖类物质，海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是昆虫体内海藻糖合成途径的关键酶。本试验通过转录组测序获得一条大豆蚜Aphis glycines（Matsumura）海藻糖合成酶的cDNA序列，命名为AgTPS（GenBank登录号：MN068811）。cDNA序列全长4174 bp，包含一个长度为2559 bp的开放阅读框，编码852个氨基酸，等电点为5.98，分子质量为95.8 kDa，具有一个典型的TPS结构域。不同温度下AgTPS基因干扰结果显示：5℃时基因沉默持续时间最长，30℃处理6 h时该基因沉默效果最好，抑制率可达79.48%，且30℃干扰后对大豆蚜生存和繁殖影响最大。试验表明该基因参与大豆蚜抗逆过程，试验结果为利用RNA干扰技术防治大豆蚜提供理论依据。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

三叶斑潜蝇热激蛋白Hsp90基因的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

采用RT-PCR及RACE技术克隆了三叶斑潜蝇Hsp90基因全长cDNA序列,并用实时定量RT-PCR的方法检测其在不同发育阶段受到高温胁迫后的表达水平。该基因的cDNA序列全长2 408 bp,开放阅读框为2 145 bp,编码714个氨基酸;5′非编码区为151 bp,3′非编码区为112 bp。该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫同源序列比较有很高的相似性（80%~99%）。聚类分析结果显示三叶斑潜蝇与美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测结果表明三叶斑潜蝇Hsp90基因的表达受到热胁迫的诱导,诱导3龄幼虫最大表达量的温度比诱导其他发育阶段的温度低,在43 ℃时预蛹和蛹的表达量在整个生命周期中最高,在检测的高温胁迫条件下,雄虫比雌虫的表达量更高。该结果为阐明三叶斑潜蝇胁迫耐受能力及其对其他潜蝇种群的取代机制奠定了分子基础。     

甘蓝夜蛾CYP9A90基因的克隆及溴氰菊酯对其诱导表达

P450 CYP9A家族基因与昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为证实溴氰菊酯对甘蓝夜蛾CYP9A基因的诱导效果,本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得甘蓝夜蛾CYP9A基因,real-time PCR检测该基因在甘蓝夜蛾不同组织中的表达差异及溴氰菊酯处理甘蓝夜蛾5龄幼虫不同时间后该基因相对表达量变化,研究结果可为甘蓝夜蛾对溴氰菊酯的抗性治理提供依据。结果表明:克隆得到甘蓝夜蛾CYP9A基因cDNA全长序列,该序列包含1 828bp,包括1个125bp的5′非编码区,1个104bp的3′非编码区和1个1 599bp的开放阅读框,编码532个氨基酸,分子量约为61.1kDa,等电点为8.84,GenBank登录号为KR676343,被国际P450命名委员会命名为CYP9A90。Real-time PCR分析结果表明,该基因在甘蓝夜蛾5龄幼虫6个组织中表达情况不同,其中在脂肪体中表达量最高。低剂量溴氰菊酯作用后不同时间点CYP9A90mRNA总体呈现诱导表达趋势。     

黏虫CYP9A134基因的克隆及其解毒功能

昆虫体内的细胞色素P450酶系统在昆虫解毒过程中发挥着重要作用。本次试验通过转录组测序获得一条新的黏虫P450基因,经国际委员会命名为CYP9A134（登录号为MT990973）。该序列全长为1801 bp,开放序列长度为1596 bp,编码531个氨基酸,分子质量为61.42 kDa,等电点为4.90。在黏虫幼虫阶段用2.5%高效氯氟氰菊酯和20%氯虫苯甲酰胺诱导时该基因表达量会有不同程度上升,最高的可分别达对照组的2.6倍和6.5倍。RNA干扰后,该基因表达量最低下降了70%,以上2种杀虫剂LD30杀虫效果分别提高了13%和25%;在黏虫成虫阶段用20%氯虫苯甲酰胺LD30诱导时,该基因表达量最高可达7.8倍。RNA干扰后,该基因表达量最低下降了61%,LD30剂量的氯虫苯甲酰胺杀虫效果提高26%。结果表明,该基因可能在杀虫剂诱导的解毒代谢过程中发挥重要作用。     

桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列，该序列全长2982 bp，含1个长度为2052 bp的开放阅读框，编码683个氨基酸组成的多肽，多肽等电点约为6.30，分子质量约为77.8 kDa；推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%，属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75，已提交至GenBank（登录号为MN068810）。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现，经LC₅₀吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC₃₀浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高；经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程，为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。     

黏虫体内两种微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

以黏虫4龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到该虫的α和β微管蛋白基因的cDNA序列各1条。其中α微管蛋白基因的cDNA序列1 443个碱基,包括一个1 353个碱基的开放阅读框,编码一个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50.0ku。氨基酸的142~148位存在一个微管蛋白标志信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端有一个酪氨酸残基,N-端存在一个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α微管蛋白氨基酸序列相同。黏虫β微管蛋白基因cDNA序列含1 906个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2ku,等电点4.75。1~4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140~146GGGTGSG位同样存在一个微管蛋白标志信号片段。序列比对表明,克隆的α和β微管蛋白基因与其他昆虫的α和β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,黏虫与家蚕(Bombyx mori)α微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.3%,与其他3种夜蛾科昆虫α微管蛋白的氨基酸序列同源性更是达到100%。黏虫与家蚕β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与烟草天蛾β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.6%。两个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号分别为EU100016和EU234504。     

玉米衰老相关蛋白基因ZmSAP的克隆与表达分析

利用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导胁迫下玉米高耐纹枯病自交系幼苗叶片所构建的cDNA文库中获得的EST序列,通过电子克隆和RT-PCR方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从玉米叶片中分离克隆到衰老相关蛋白基因的全长cDNA序列,命名为ZmSAP(GenBank登录号:GU253311)。序列分析表明,ZmSAP全长1156bp,包含一个完整的603bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码200个氨基酸,相对分子量为21.92kD,等电点为10.38。该氨基酸序列与豌豆、挪威云杉、寄生藻等有不同程度的同源性且在不同物种间具有一个保守结构域,染色体定位发现该基因位于玉米第1条染色体上。荧光定量PCR分析表明,在高耐纹枯病自交系R15和高感纹枯病材料478中ZmSAP基因在病菌胁迫初期呈诱导表达,可能参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程,说明该基因与纹枯病菌胁迫响应机制密切相关。     

麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列,明确其典型特征,为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列,利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584）,SaNa_v1序列长3423 bp,共编码1141个氨基酸;SaNa_v2序列长2874 bp,共编码958个氨基酸。同源比对发现,SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%;SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域,每个结构域6个跨膜片段（S1～S6）,存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因,为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。