一株具有溶藻特征的假单胞菌分离鉴定及其溶藻动力学研究

从田螺内脏中分离获得一株溶藻菌株(命名为W10),利用16S rDNA序列分析及生理生化特征对该菌株进行了鉴定,探究了其对铜绿微囊藻的作用方式、菌液及其无菌上清液在不同条件下的溶藻特性,并构建了溶藻动力学模型。结果表明:菌株W10归属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.,GenBank ID为MN688696);W10溶藻式是通过分泌某些热稳定性差的溶藻物质间接作用于铜绿微囊藻,使其裂解、溶解;NA和淀粉培养基对W10菌株的培养效果无显著差异(P0.05),二者显著优于改良基础培养基(P0.05),但因NA培养基成分复杂,故确认淀粉培养基适宜于菌株W10培养;同一生长时期的菌液及其无菌上清液溶藻效果无显著差异(P0.05),二者均表现为稳定期与衰亡期最高,二者无显著差异(P0.05),然后依次是对数期和延滞期;当菌液与藻液体积比为1∶10时,W10菌液溶藻率最高为80.05%,而无菌上清液的溶藻效果与投加量呈正相关,在1∶2处理溶藻率最高为92.15%;当菌藻比1∶10以铜绿微囊藻为降解底物时,菌株W10的溶解作用遵循一级反应动力学。     

铜绿假单胞菌遗传演化分析

为研究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)的遗传演化规律,对2018年本实验室分离出两株铜绿假单胞菌,经基因测序得到16s r RNA基因序列,利用NCBI中的BLAST对比搜索与分离菌株具有相近基因序列的假单胞菌株,采用lasergene中Megalign软件构建基因进化树并比较分析。结果表明:Pa菌株在基因进化树上聚为一支,说明Pa进化较稳定,分离出的两株Pa与来自日本的Pa(登录号为NR_113599)关系最为亲近,他们聚在一个次级分支上;分离菌株与来自美国的两株Pa(登录号为NR_117678与NR_114471)关系较亲近,而与来自德国的Pa(登录号为NR_026078)关系则较远。     

铜绿假单胞菌菌剂载体的筛选

为将铜绿假单胞菌应用于重金属污染环境的生物修复,以硅藻土(1~3 mm)、硅藻土(3~6 mm)、活性炭和轻石为材料,通过测定不同材料的吸水率、菌体吸附与释放作用及制备菌剂的活菌数,筛选出适宜的菌剂载体.结果表明,在设定的载体浓度下(0~20 g·L-1),不同载体的菌体去除率随浓度提高而增大,Q值在4.90%~49.60%之间;载体负载量随浓度提高而减小,L值在923.33~82.83 mg·g-1之间;硅藻土、活性炭的Q值在30 min达到最大.硅藻土(1~3 mm)、硅藻土(3~6mm)、活性炭和轻石的吸水率依次为60.3%、43.3%、23.4%和33.1%;以上4种载体制备的菌剂(菌剂A、B、C和D)的活菌释放率依次为27.4%、28.8%、19.7%和37.1%.室温保存30 d后,菌剂A活菌数为6.25×108CFU·g-1,减少了78.4%,菌剂B活菌数为1.12×1010CFU·g-1,是初始值的5.38倍,菌剂C的活菌数为2.95×108CFU·g-1,减少了73.9%,菌剂D的活菌数为3.61×109CFU·g-1,增殖了127.0%.可见,载体浓度及吸附时间显著影响其对菌体的吸附作用,3~6 mm硅藻土的负载量适中,菌体存活率高,活菌释放率高,可作为铜绿假单胞菌的菌剂载体.     

2株林麝肺源铜绿假单胞菌毒力及致病性比较

【目的】比较表型差异的林麝肺源铜绿假单胞菌ZP-1株（不产绿脓菌素）和BX-1株（产绿脓菌素）的毒力表达情况以及在小鼠急、慢性肺部感染时的致病性,为林麝化脓性肺炎的治疗与防控提供依据。【方法】比较ZP-1株和BX-1株的毒力因子表达差异,利用无创式气管插管滴注和制备琼脂糖包埋株的方法,建立ZP 1和BX 1株的小鼠急、慢性肺部感染模型,并检测小鼠急性、慢性感染肺脏残留铜绿假单胞菌数、白细胞总数和细胞因子含量,观察病理组织学变化。【结果】在体外培养条件下,ZP-1株的脓青素和胞外多糖表达量显著高于BX-1株（P<0.05）;BX-1株的胞外蛋白酶（LasA、LasB）活性高于ZP-1株,但二者差异不显著（P>0.05）;BX-1株鼠李糖脂表达量显著高于ZP-1株（P<0.05）;ZP-1株与BX-1株的脂多糖结构具有明显差异,特别是核心多糖处。小鼠急性肺部感染12 h时,ZP-1组小鼠肺组织铜绿假单胞菌残留数、白细胞总数和细胞因子水平均高于BX-1组小鼠;感染24 h时,BX-1组小鼠IL-1β、IL-6含量超过ZP-1组。随着慢性肺部感染时间的延长,ZP-1组和BX-1组小鼠肺组织铜绿假单胞菌残留数、白细胞总数和IFN-γ含量均逐渐降低,IL-1β和IL-6含量均逐渐升高;除感染后第3天外,其余感染时间段ZP-1组小鼠肺组织白细胞总数均高于BX-1组;除感染后第14天外,其余感染时间段ZP-1组小鼠肺组织IL-1β、IL-6含量均高于BX-1组;在同一感染时期ZP-1组和BX-1组小鼠肺组织IFN-γ含量无明显差异。【结论】林麝肺源铜绿假单胞菌ZP-1株对肺部感染的小鼠致病性更强。     

貂源铜绿假单胞菌耐药性及生物学特性

为了解貂源铜绿假单胞菌流行株基本特性,对分离的20株铜绿假单胞菌进行药物敏感性试验、血清型鉴定、ToxA基因检测、强毒株筛选及绝对致死量(LD_(100))测定。结果表明,铜绿假单胞菌分离株耐药现象比较严重,对氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林和四环素不敏感,对妥布霉素敏感率为95%;铜绿假单胞菌分离株的血清型为G型和B型,分别占85%和15%;20株铜绿假单胞菌均能检测出毒素基因ToxA;小鼠致死性试验表明,铜绿假单胞菌分离株之间毒力差异很大,少数菌株如ZHDL9、ZHDL6等均表现出较强的毒力。以菌株ZHDL9为代表株建立小鼠鼻腔感染模型,采用建立的感染模型测定得菌株ZHDL9对小鼠的LD_(100)为5×10~7 cfu。由此可见,分离的20株铜绿假单胞菌对临床常用抗生素耐药严重,对妥布霉素的敏感率为95%,提示该种抗生素可用于临床治疗水貂出血性肺炎,而菌株ZHDL9可作为生物制品研发的候选菌株。     

景天三七对多重耐药铜绿假单胞菌的抑菌作用

目的研究景天三七醇提物和水提物对多重耐药铜绿假单胞菌的体外抗菌作用。方法采用试管稀释法测定景天三七醇提物和水提物对20株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果景天三七醇提物和水提物对20株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌有不同程度的抗菌作用,醇提物对铜绿假单胞菌的MIC50为0.125g.mL-1,水提物对铜绿假单胞菌的MIC50大于0.5g.mL-1。结论景天三七醇提物体外对铜绿假单胞菌有较强的抗菌作用。     

草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵条件的优化

为优化铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗菌液发酵及灭活条件。通过单因素试验对铜绿假单胞菌JP802摇瓶培养温度、pH、接种量、转速4因素进行了优化筛选,采用正交试验法对发酵条件的参数进行了优化,并进行了验证试验及5 L发酵罐生长曲线;同时对铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗发酵菌液灭活条件进行优化。试验结果表明,铜绿假单胞菌JP802株最适发酵条件为28℃,pH7.5,以10%接种量,转速270 r/min,通气量4 L/min,发酵培养12～14 h。灭活条件优化结果表明在灭活温度为37℃条件下,福尔马林终浓度在0.40%,灭活48 h即能完全灭活。通过对发酵条件的优化,可以获得更高产量的铜绿假单胞菌JP802发酵菌液。     

126例铜绿假单胞菌感染的药敏分析

目的：观察铜绿假单胞菌的耐药情况，指导临床有效地应用抗生素。方法；用VITEK-AMS药敏卡GNS-F2、F3对鉴定出来的126株铜绿假单胞菌即时进行药敏试验。结果：丁胺卡那、环丙氟哌酸敏感率最高，分别为89．3％、88．6％；氨苄青霉素、先锋一号、呋喃坦啶、四环素等抗生素均处于耐药状态。结论：羧苄青霉素、庆大青霉素等抗生素的敏感率有逐渐下降趋势；来自痰、伤口分泌物、尿的菌株对同一种抗生素的敏感率无明显差别，提示铜绿假单胞菌的感染可能来源于同一传染途径或同一感染源。     

母狐铜绿假单胞菌性子宫内膜炎的诊治

本文为母狐发生的一种以子宫内膜发炎、流产为主要特征的繁殖障碍性疾病,经临床流行病学调查和实验室诊断,确定为铜绿假单胞菌性子宫内膜炎,经过科学施治,效果良好,可供养殖户参考。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达

[目的]对铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因进行原核表达。[方法]利用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到脂肪酶基因,测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建脂肪酶基因的原核表达载体,加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L诱导蛋白表达4 h,并进行SDS-PAGE电泳。[结果]从铜绿假单胞菌中克隆的脂肪酶基因成熟肽的序列,与NCBI上所递交的铜绿假单胞菌脂肪酶序列同源性很高,达99.36%。成功构建了脂肪酶基因的原核表达载体pET32a-Lip,进一步SDS-PAGE电泳结果显示目的基因得到高效表达。[结论]克隆的铜绿假单胞菌脂肪酶带有自身的信号肽,也可以在大肠杆菌中正常表达,可以用于进一步的研究。     

鸡场铜绿假单胞菌外毒素 A 基因遗传变异分析

为探究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)毒力因子变异情况,对鸡场分离、鉴定的7株PA分离菌外毒素A(Exotoxin A,ETA)基因进行了遗传变异分析。结果表明,鸡场分离鉴定的7株PA分离菌成熟的ETA结构蛋白基因长1 824和1 839 bp,编码608和613个氨基酸;7株分离菌ETA基因与27株PA参考菌株之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98.9%～100.0%,98.5%～100.0%。7株分离菌成熟的ETA结构蛋白基因共有多处碱基位点发生了变异,其中包括PA-47株第106～110位15个碱基的连续缺失和10处错义突变。7株PA分离菌ETA蛋白共有6种不同的氨基酸变异位点模式;第426位(H)、第440位(H)、第470位(Y)、第481位(Y)、第553位(E)和第558位(W)氨基酸残基均未发生突变,均为有毒形式。本研究结果可为PA致病机理研究提供参考依据。     

铜绿假单胞菌Z1产鼠李糖脂理化性质的研究

[目的]为分析前期研究获得的产糖脂铜绿假单胞菌株及其发酵产物应用于石油、食品、环境和农业等领域的潜力,从而对该糖脂粗提物的理化性质进行研究。[方法]检测铜绿假单胞菌Z1发酵产生鼠李糖脂粗提物的CMC,并研究其在不同温度、盐度、酸碱度下表面活性的稳定性,同时与化学表面活性剂SDS进行比较。[结果]Z1产鼠李糖脂在-20℃常压和121℃的高温高压下表面张力均保持在40 mN/m以下,在NaCl浓度达30%情况下,表面张力也保持在37 mN/m以下,但在pH<4及pH>10的情况下,其表面张力均大于40 mN/m,分析可得其对温度、盐度表现极强的耐受性,但对酸碱度的耐受性较弱。[结论]该研究表明,鼠李糖脂表现具有极高的温度和盐度耐受性,且研究中的铜绿假单胞菌菌株或其发酵获得的糖脂粗提物具有推广应用于石油等领域的潜力。研究不足之处在于该糖脂在酸碱度的耐受性方面较弱,需进行改进。     

草鱼铜绿假单胞菌的鉴定及药物敏感性分析

从患病草鱼C tenopharyngodon idella体表病灶上分离到一株优势菌,经分离纯化培养制成细菌悬液,分别以腹腔注射和浸泡两种方式感染草鱼。结果表明:该菌株能感染草鱼,且具较强毒力,腹腔注射0.2mL该菌液(3×109cfu/mL),可导致受试草鱼100%死亡;创伤浸泡感染(3×108cfu/mL),死亡率也达100%,受感染鱼出现与自然感染相似的类似赤皮病症状。对该病菌进行形态特征观察和主要理化特性分析,初步鉴定为铜绿假单胞菌Pseudom onas aeruginosa。进一步对该菌进行分子鉴定,共选用16S rRNA、RNA聚合酶β亚单位(rpoB)和促旋酶亚单位蛋白(gyrB)3个基因进行鉴定分析。序列克隆与BLAST分析结果显示,这3个基因均与GenBank上登录的铜绿假单胞菌的相应序列具有很高的同源性,16S rRNA、rpoB和gyrB基因与已知铜绿假单胞菌相应序列的同源性分别在99%、98%和93%以上。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为铜绿假单胞菌。药敏试验结果显示:该菌对阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11种药物高度敏感,对链霉素和庆大霉素中度敏感,对罗红霉素、红霉素、四环素、苯唑青霉素、新霉素和头孢氨苄等16种药物具有耐药性。     

草鱼铜绿假单胞菌的鉴定及药物敏感性分析

从患病草鱼C tenopharyngodon idella体表病灶上分离到一株优势菌,经分离纯化培养制成细菌悬液,分别以腹腔注射和浸泡两种方式感染草鱼。结果表明：该菌株能感染草鱼,且具较强毒力,腹腔注射0.2mL该菌液（3×109cfu/mL）,可导致受试草鱼100%死亡;创伤浸泡感染（3×108cfu/mL）,死亡率也达100%,受感染鱼出现与自然感染相似的类似赤皮病症状。对该病菌进行形态特征观察和主要理化特性分析,初步鉴定为铜绿假单胞菌Pseudom onas aeruginosa。进一步对该菌进行分子鉴定,共选用16S rRNA、RNA聚合酶β亚单位（rpoB）和促旋酶亚单位蛋白（gyrB）3个基因进行鉴定分析。序列克隆与BLAST分析结果显示,这3个基因均与GenBank上登录的铜绿假单胞菌的相应序列具有很高的同源性,16S rRNA、rpoB和gyrB基因与已知铜绿假单胞菌相应序列的同源性分别在99%、98%和93%以上。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为铜绿假单胞菌。药敏试验结果显示：该菌对阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11种药物高度敏感,对链霉素和庆大霉素中度敏感,对罗红霉素、红霉素、四环素、苯唑青霉素、新霉素和头孢氨苄等16种药物具有耐药性。     

下呼吸道铜绿假单胞菌感染细胞的耐药性监测

铜绿假单胞菌已成为下呼吸道感染的重要病原菌之一,且耐药性逐年增高,已引起人们的重视。本文对下呼吸道感染患者痰培养中分离出的33株铜绿假单胞菌进行耐药性分析。1　材料与方法1.1　病原菌分离与检测选择本院1997年7月至1999年7月住院确诊为下呼吸道感染的患者329例,所有患者住院后第2天早晨(未使用抗生素),用生理盐水漱口,用力咳嗽,从呼吸道深部咳出新鲜痰于无菌痰杯,即送实验室检查,痰直接涂片光镜检查评价痰标本质量,合格痰标本接种培养基,置37℃温箱孵育24～48h,阳性标本进行微生物鉴定。1.2　病原菌药敏试验用纸片扩散法,按照美国临…     

应用高光谱图像拟合铜绿假单胞菌的生长

[目的]本文旨在开发一种新颖、快速、无损的方法模拟铜绿假单胞菌的生长。[方法]利用高光谱图像技术获取铜绿假单胞菌在营养琼脂平板上培养0、12、24、36和48 h的图像和光谱参数,采用部分短波近红外波长范围的平均光谱值、高光谱图像的掩模图形和480~1 000 nm波段内光谱值的第1主成分共3种方法来模拟铜绿假单胞菌的生长。[结果]对初始浓度为102和104CFU·m L-1的假单胞菌所建立的模型训练集决定系数(R2)为0.970 1~0.993 2,平方误差和(SSE)为0.000 03~0.080 61,验证集R2为0.805 7~0.954 2,SSE为0.000 28~0.104 61。3种基于高光谱图像特征参数建立的模型与基于菌落计数法建立的模型之间的相关系数均超过0.900,说明基于高光谱图像参数建立的假单胞菌生长模型符合其实际生长情况。基于部分波长范围的平均光谱值和基于高光谱图像的掩模图形建立的拟合模型比第1主成分得分建立的模型与数据拟合效果更好,具有更高的准确性。同时,对480~1 000 nm波段范围内的光谱值进行主成分分析(PCA),发现2种浓度的铜绿假单胞菌的5个检测阶段只有部分样品点重叠,相互之间可以区分。[结论]高光谱图像技术可以用来对铜绿假单胞菌的生长状况进行区分和模拟,为进一步对冷鲜肉中的铜绿假单胞菌检测奠定基础。     

蟒蛇铜绿假单胞菌的分离鉴定及抗药性分析

为了确认死于急性支气管炎、肺炎的蟒蛇致病病原,对死亡蟒蛇的肝、肺组织及心血进行病原分离培养,获得1株分离菌株,并对其进行形态学、培养特性、生化特性测定及动物致病试验。结果表明,分离菌株为铜绿假单胞菌,是本病致病病原;对分离菌株进行24种常用抗菌药物的药敏试验,结果表明,该菌株对氟苯尼考、妥布霉素、氯霉素和环丙沙星敏感,对红霉素、氟哌酸、氨苄青霉素、头孢拉定、新霉素、复方新诺明、卡那霉素、罗红霉素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、阿莫西林、庆大霉素、四环素等多种抗菌药物产生耐药,且呈多重耐药性。     

1株假单胞菌oprD基因缺失和回补载体的构建

[目的]构建假单胞菌毒性基因(oprD)缺失突变株,为进一步探讨其编码的毒力因子功能奠定基础。[方法]利用pEX18Gm质粒作为基因敲除的载体,构建假单胞菌oprD基因重组自杀质粒,通过同源重组并激活自杀基因方式,筛选到目的基因缺失的突变株,再利用pBBR1MCS-2质粒作为目的基因回补的载体,构建回补载体。[结果]同源重组后,经过庆大霉素和氯霉素双抗平板、蔗糖平板筛选和PCR鉴定,成功获得了oprD基因缺失突变株,类似操作获得了回补菌株。[结论]基因缺失突变株的成功构建可为下一步的毒性机理研究奠定基础。     

铜绿假单胞菌在标本中的分布及药敏试验

铜绿假单胞菌在标本中的分布及药敏试验梁陶，冯欣，陈光远（广东医学院附属医院检验科，湛江５２４００１）铜绿假单胞菌通常寄居于人体的肠腔、皮肤等处，外环境也可存活，属重要的机会致病菌。目前，由于多种抗生素、激素、抗癌药或免疫抑制剂的使用，人体的免疫系统受...