新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段。并将其克隆至pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明，6个NDV分离株HN基因片段长度均为1704bp，编码568个氨基酸；彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为96．0％～99．8％和98．6％～100％，与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为96．8％～98．4％；但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低，为88．2％～91．0％。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的序列分析

使用RT－PCR的方法扩增得到有代表性的地方分离株新城病毒（NDV）的保护性抗原HN基因，经序列测定及分析发现，该毒株HN基因与日本1985年分离的CHI／85株亲缘关系最近，氨基酸同源性达97．0％，与中国标准强毒株F48E8氨基酸同源性为89．8％，其抗原位点Ⅰ发生突变，在347位由Glu变异为Gly，系统进化树归于C族。     

2株新城疫病毒广西分离株HN基因的克隆与序列分析

用设计的特异性引物,通过RT-PCR法对2013年间分离自广西的具有一定代表性的2株鸡新城疫病毒(GX-79-13-Ch,GX-117-13-Ch)进行HN基因的扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为1 716 bp,二者之间的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸同源性为99.0%。2个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为81.2%~97.5%,推导氨基酸序列同源性为88.2%~97.6%。由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有较高的同源性,表明2个分离株与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系。     

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。     

新城疫病毒长春株F基因和HN基因的序列分析

从长春地区分离到一株新城疫病毒,经过对其进行生物学研究表明该毒株具有新城疫病毒弱毒株的一些特性,本试验通过ＲＴ－ＰＣＲ方法测定出该毒株Ｆ基因的核苷酸序列为１７５８ｂｐ,编码有５３３个氨基酸残基;ＨＮ基因核苷酸序列为１７３１ｂｐ,编码５７７个氨基酸残基,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较。Ｆ基因核苷酸序列的同源性在８８．２％～９６．７％之间,氨基酸序列同源性在９０．１％～９     

新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析

为确定西藏新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,本试验应用RT-PCR技术对西藏NDV分离株HN基因进行扩增,然后克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前疫苗株进行比对及系统发育分析。结果表明,NDV分离株HN基因片段长度为1734 bp, 编码577个氨基酸;推导的氨基酸序列均有5个糖基化位点, XZ10和XZ17有12个半胱氨酸残基,XZ20只有11个半胱氨酸残基。NDV西藏分离株HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性在81.1%~93.0%之间,氨基酸同源性在81.1%~93.6%之间;与疫苗株核苷酸同源性在87.8%~98.7%之间,氨基酸同源性在88.0%~98.9%之间。系统进化分析结果表明,NDV西藏分离株HN基因均属于Ⅱ型。     

新城疫病毒B_(95)株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据 NDV　 HN蛋白已知基因序列设计一对引物 ,以提取的澳大利亚布里斯班 NDV分离株 B95基因组 RNA为模板 ,利用 RT- PCR技术扩增得到一条约 1.9kb的条带。将扩增产物克隆到 PGEM- T- easy载体中 ,并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了 HN基因的阳性重组子 ,随后采用 Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得该基因全长序列 ,并进行同源性分析。 B95株与其他毒株核苷酸同源性为 95 .1%～ 87% ,氨基酸同源性为96 .1%～ 92 .1%。     

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000~2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基。其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点。除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E)。与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%~97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%~98.1%之间。     

新城疫病毒四平株HN蛋白基因的克隆与序列分析

新城疫病毒（ＨＤＶ）四平株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ四平株的全长ＨＮ基因。将该ＨＮ基因插入ｐＫＳ后测序。序列分析表明，该ＨＮ基因核苷酸长度为１７４２ｂｐ，编码５７１个氨基酸，序列中有５个糖基化位点，１２个半胱氨酸残基。同源性分析表明，四平株ＨＮ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＨＮ基因相比，核苷酸序鲁同源性在８３．４￣８９．２％之间，推导的氨基     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的克隆及遗传变异分析

对河北省保定地区两个NDV分离株用RT-PCR技术扩增其HN基因片断,产物经转化、克隆和测序,参照国内外已发表新城疫代表株绘制NDV系统发育进化树并分析其遗传关系,结果表明,两个分离株HN基因在遗传上同源性高达99.7%,两个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为82.8%～93.2%,推导氨基酸序列同源性为90.0%～96.0%,由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系.     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

一株野鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的F基因序列设计了1对特异性引物,成功地对其中一株野鸭源NDV的F基因进行了克隆、测序,并推导其氨基酸序列,选择F基因部分片段绘制了遗传进化树。F基因全长1 662 bp,单一的阅读框架编码553个氨基酸,构成的F蛋白上有13个Cys残基位点和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-116R-117F。遗传进化分析表明,该NDV分离株为基因Ⅶ型NDV,与近年来我国家禽中所报道的NDV的基因型相一致。     

11株新城疫病毒广西分离株P基因的克隆和序列分析

根据基因库的新城疫病毒(NDV)的磷蛋白(P)基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对11个NDV广西分离株的P基因进行RT-PCR扩增和序列测定,P基因阅读框的核苷酸序列全长均为1188bp,编码395个氨基酸。核苷酸及氨基酸全序列比较分析,结果表明:11个NDV广西分离株与10个参考株的核苷酸序列同源性为81.2%～97.8%,氨基酸同源性为78.8%～97.0%。     

一株鸽源新城疫病毒主要毒力基因分析

对2008年从广州市白云区某发病信鸽养殖场分离鉴定的一株鸽源新城疫病毒(简称CP-GD-2008),运用RT-PCR方法扩增出该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定。经序列对比、进化分析发现,CP-GD-2008属于基因Ⅵb亚型毒株,F蛋白具有强毒株裂解位点序列112R-R-Q-K-R-F117。该毒株与欧洲流行的鸽源基因Ⅵb亚型毒株进化关系密切,表明该毒株与欧洲分离株可能存在共同来源。对F和HN蛋白功能研究发现,除HN蛋白第347位抗原位点由E突变为G外,F和HN蛋白的中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。     

抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体基因的克隆与序列分析

从分泌抗新城疫HN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA,经RT-PCR扩增抗体轻、重链可变区基因,然后与L inker连接组装成单链抗体基因(scFv),其排列方式为VL-linker-VH。结果,成功地构建了scFv基因,序列分析表明,scFv基因长为744 bp,其中VH基因长为366 bp,VL基因长为333 bp。单链抗体基因的构建为抗新城疫HN蛋白基因工程抗体的制备奠定了基础。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。