鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

锯缘青蟹黄水病病原菌的分离与鉴定

[目的]确定锯缘青蟹黄水病致病菌的病原。[方法]对从患黄水病的锯缘青蟹体内分离出的28株致病菌株进行培养、形态鉴定、生理生化鉴定和人工感染等试验。[结果]分离出的菌株均为弧菌科细菌,其中嗜水气单胞菌12株、辛辛那提弧菌8株、副溶血弧菌5株、温和气单胞菌3株。[结论]4种菌株均为青蟹黄水病的病原菌,其中嗜水气单胞菌为优势种群。     

纳米载铜蒙脱石体外对三种水产病原菌及两种肠道有益菌杀菌作用

采用抗菌材料纳米载铜蒙脱石于不同浓度、不同温度、不同作用时间,分别对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌(水产病原菌)及嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌(肠道有益菌)进行杀菌作用比较.结果表明:随浓度增加,纳米载铜蒙脱石对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和副溶血弧菌的杀菌效果不断增强;而对于枯草芽孢杆菌和嗜酸乳酸杆菌,杀菌作用虽有增加,但增加幅度较小.此外,不同温度,杀菌率不同,并随着时间的延长而增加.在30 ℃下,Cu2+-MMT对细菌的杀菌性能优于4 ℃.在30 ℃下培养嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、嗜酸乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌12 h,杀菌率分别为100%、100%、100%、24.9%和25.6%.而在4 ℃培养24 h后,其杀菌率分别为83.9%、84.8%、84.6%、20.9%和21.4%.     

嗜水气单胞菌和温和气单胞菌快速PCR方法检测

本研究根据GenBank数据库已发表的气单胞菌属16S rDNA序列,设计嗜水气单胞菌、温和气单胞菌16S rDNA序列的特异保守区,建立这2种菌的快速PCR检测方法。结果表明,仅嗜水气单胞菌和温和气单胞菌得到了特异性扩增,而几种常见弧菌科水产病原菌,包括豚鼠气单胞菌、易损气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和鳗弧菌并未得到特异性扩增,说明设计的引物可以用于这2种病原的PCR快速检测方法的建立,可以为水产动物嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的快速检测、病害预警和病原调查提供技术支撑。     

厚朴酚和黄藤素对鱼类3种常见致病菌的抑制效应

采用二倍稀释法和滤纸片法,分别将厚朴酚和黄藤素两种植物活性成分配制成6种不同质量浓度的药液,并制作成药敏滤纸片,对鱼类3种常见致病菌(嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、温和气单胞菌Aeromonas sobria、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus)进行体外抑菌试验,旨在研究厚朴酚和黄藤素对鱼类3种常见致病菌的抑菌效应。结果表明:厚朴酚和黄藤素对嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌有显著的抑制作用(P0.05),厚朴酚质量浓度为3.125 mg/m L时对嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的抑菌圈直径为(15.13±0.29)mm,(15.70±0.34)mm,具有高敏感性;随着黄藤素质量浓度的降低,嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌抑菌圈直径逐渐减小。厚朴酚和黄藤素对温和气单胞菌均无抑菌作用(P0.05)。     

大黄等5种中草药对两种锯缘青蟹致病菌的体外抑菌活性

[目的]研究大黄、黄芩、金银花、杜仲与大枣及其复方A（大黄.黄芩）、B（大黄·黄芩·金银花）、C（大黄.黄芩.杜仲）和D（大黄.黄芩.杜仲.大枣）对锯缘青蟹（Scylla serrata）常见致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的体外抑菌效果。[方法]通过纸片法测定细菌对药物的敏感性。分别采用稀释法与平皿法测定最小抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC）。[结果]副溶血弧菌对单方的的敏感度为黄芩〉金银花〉大黄〉大枣〉杜仲,其复方的抑菌效果为A=B=C〉D。其中,黄芩、A、B、C和D对副溶血弧菌的杀菌作用较强。嗜水气单胞菌对单方的敏感度依次为大黄〉黄芩〉金银花〉大枣〉杜仲,其复方的抑菌效果为A〉B〉C=D。其中,大黄与复方C对嗜水气单胞菌的杀菌作用较强。[结论]大黄、黄芩、金银花、杜仲与大枣及其复方对副溶血弧菌和嗜水气单胞菌有良好的抑菌效果,能用于锯缘青蟹疾病的治疗。     

大黄提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果

测定了大黄提取物对水产养殖中常见病原菌的最小抑菌浓度及其对嗜水气单胞菌体内和体外抑菌效果。结果显示,大黄提取物对水产养殖中的常见病原菌嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均为250μl/L,点状产气单胞菌、鳗弧菌、苏伯利产气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌的MIC与MBC均为500μl/L,肠型点状产气单胞菌的MIC与MBC均为1 000μl/L。药敏试验结果发现,大黄提取物对嗜水气单胞菌抑菌圈的直径为(20.4±1.3)mm,氟哌酸的抑菌圈直径为(33.0±1.6)mm,氯霉素为(29.0±2.8)mm。攻毒试验结果显示,在攻毒7 d后,对照组死亡率为40.00%,饲料中添加0.5%大黄提取物的试验组死亡率为6.67%,添加4%的试验组的死亡率为20%,添加1%和2%的试验组没有鱼死亡,表明饲料中添加1%的大黄提取物能有效增强鱼体对嗜水气单胞菌的抵抗能力。本试验结果说明,大黄提取物对水产养殖中常见的病原菌具有良好的抑菌效果,对嗜水气单胞菌的抑菌效果与抗生素类抗菌药物相当,能够增强机体免疫力,对细菌性疾病具有较强的预防作用。     

基于氧化石墨烯生物免疫传感器检测副溶血弧菌的研究（英文）

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是最为严重的水产动物致病菌之一,准确即时的检测手段是预防控制该菌传播的关键所在。通过量子点(QDs)标记副溶血弧菌鞭毛蛋白抗体(Ab),利用生物免疫传感器技术实现副溶血弧菌的快速、特异性检测。结果显示,QDs-Ab的荧光通过加入氧化石墨烯(GO)产生淬灭,构建了捕获目标细菌的探针,氧化石墨烯最适淬灭浓度为60 ng/ml。细菌捕获探针中加入副溶血弧菌后,能够检测到重新恢复强度的绿色荧光。副溶血弧菌的检出限达到104 CFU/m L。针对副溶血弧菌设计的生物免疫传感器的特异性,选取灿烂弧菌、溶藻胶弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌作为对照,结果显示,对照组不能明显引起荧光强度的改变,而试验组却能显著提高荧光强度。该研究建立的基于荧光能量共振转移(FRET)的具有高灵敏度和特异性的生物传感器检测方法在细菌的早期诊断中有良好的应用潜质。     

基于氧化石墨烯生物免疫传感器检测副溶血弧菌的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是最为严重的水产动物致病菌之一,准确即时的检测手段是预防控制该菌传播的关键所在.通过量子点(QDs)标记副溶血弧菌鞭毛蛋白抗体(Ab),利用生物免疫传感器技术实现副溶血弧菌的快速、特异性检测.结果显示,QDs-Ab的荧光通过加入氧化石墨烯(G0)产生淬灭,构建了捕获目标细菌的探针,氧化石墨烯最适淬灭浓度为60 ng/ml.细菌捕获探针中加入副溶血弧菌后,能够检测到重新恢复强度的绿色荧光.副溶血弧菌的检出限达到104 CFU/mL.针对副溶血弧菌设计的生物免疫传感器的特异性,选取灿烂弧菌、溶藻胶弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌作为对照,结果显示,对照组不能明显引起荧光强度的改变,而试验组却能显著提高荧光强度.该研究建立的基于荧光能量共振转移(FRET)的具有高灵敏度和特异性的生物传感器检测方法在细菌的早期诊断中有良好的应用潜质.     

南宁市售文蛤中弧菌的分离鉴定

【目的】对从南宁市售文蛤体内分离获得的待测菌株进行鉴定,为掌握了解广西文蛤产品中弧菌科细菌的带菌情况提供参考依据。【方法】用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（TCBS）从南宁海鲜市场的文蛤中分离获得4株细菌,观察其菌落形态,对分离菌株进行生理生化特性鉴定及16SrRNA基因序列进行克隆、测序,运用DNASTAR中的MegAlign软件进行序列分析,并构建系统进化树。【结果】TCBS培养基30℃培养24h后,菌株No．8和No．9生长良好,形成直径2mm左右、圆形、隆起的菌落;菌株No．10、No．11生长不良,部分形成直径1mm左右、圆形、隆起的黄色菌落。菌株生化鉴定结果表明,菌株No．8、No．9在无盐蛋白胨水中不生长,且不能分解葡萄糖;而菌株No．10、No．11可在无盐蛋白胨水中生长,且能分解葡萄糖并产气。16SrRNA序列系统进化树显示,菌株No．8与副溶血弧菌聚集为一个分支,No．9与河流弧菌聚集为一个分支,No．10、No．11则分别与斑点气单胞菌、嗜水气单胞菌聚集为一个分支。综合表型和分子特征可知,菌株No．8为副溶血弧菌,No．9为河流弧菌,No．10为斑点气单胞菌、No．11为嗜水气单胞菌。细菌药敏结果显示,4株分离菌株对四环素、环丙沙星、先锋噻肟、先锋必均表现为高度敏感。【结论】南宁市售文蛤产品主要是污染了弧菌属及气单胞菌属细菌,生产上可选用四环素、环丙沙星、先锋噻肟、先锋必等药物进行防治。     

锦鲤疱疹病毒潜伏感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异和敏感的检测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)潜伏感染的方法,以KHV Sph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立Real–Time PCR检测方法,并且对该方法进行特异性和敏感性评估及临床样品应用研究。结果显示:建立的方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42拷贝/μL,灵敏度高。用本方法对63份临床样品进行检测,有锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;从有临床症状的鱼中得到的15份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;30份无任何临床症状鱼中的6份被检测为阳性,阳性率为20%。本试验中建立的水生动物疱疹病毒潜伏感染快速检测方法,可为潜伏感染KHV的临床检测提供一种快速、敏感和特异的检测手段,可为KHVD的分子流行病学调查和预防提供参考。     

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析

提取感染锦鲤疱疹病毒(KHV)的锦鲤(Cyprinus carpio koi)肾脏组织DNA,通过PCR扩增了KHV ORF132基因。该基因全长513 bp,所编码的蛋白包含170个氨基酸,分子量18.5 ku,等电点8.11,有信号肽以及2个潜在的O糖基化位点。应用DNA Star程序,通过综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性、抗原性指数,预测KHV ORF132蛋白主要B细胞表位区段位于Leu40～Ala45、Asn53～Pro66、Arg97～Thr118、Ala125～Pro136、Glu140～Arg145、Asn160～Arg170。     

饲料浮萍水平对黄金锦鲤生长性能、消化酶活力及抗氧化能力的影响

为研究浮萍Lemna minor对黄金锦鲤Cyprinus carpio生长性能、抗氧化和消化能力的影响,以初始体质量为(52.99±1.95)g的黄金锦鲤为研究对象,在饲料中分别添加0、3%、6%、9%、13%、14%的浮萍,相应替代同等水平的菜粕,制成6组等氮(粗蛋白质为38.5%~38.6%)、等能(12.2 MJ/kg)的饲料,分别记为D1(对照)、D2、D3、D4、D5、D6饲料组,将540尾健康的黄金锦鲤随机分成6组,每组设3个重复,每个重复放30尾鱼,养殖时间为8周。结果表明:D6饲料组增重率(WGR)、蛋白质效率(PER)、特定生长率(SGR)和肥满度(CF)均显著高于对照组及添加水平为3%的饲料组(P0.05),而其饲料系数(FCR)显著低于上述两组(P0.05);D6饲料组蛋白酶活力与脂肪酶活力显著高于其他饲料组(P0.05),各饲料组间淀粉酶活力则无显著性差异(P0.05);D4与D6饲料组肝胰脏、脾脏、肾脏和血清中的超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)活力显著高于其他饲料组(P0.05),且D6饲料组丙二醛(MDA)活力显著最低(P0.05)。研究表明:本试验条件下,饲料中浮萍的添加水平在14%时,有利于黄金锦鲤的生长,并能提高鱼体抗氧化能力与消化酶活力。     

池塘养殖锦鲤体表溃疡病的组织病理学观察

为临床诊断和防治锦鲤Cyprinus carpio koi皮肤溃疡病,采用病理解剖方法对患病锦鲤进行临床观察和组织病理学分析,试验用患病锦鲤取自上海市朝阳锦鲤养殖场发病池塘,确定病鱼10尾(编号1~10),取每条病鱼的组织进行病理解剖、石蜡切片、H-E染色。结果表明:患病锦鲤体表溃疡病处的病灶组织出现严重淤血、炎性细胞浸润并聚集、肌束溶解和坏死等典型病理表现;体表溃疡病是由致病菌局部感染所致,并未全身性感染,10尾病料的脾组织均表现出血管扩张、管壁增厚、血管周围的实质组织凝固变性,伴有红细胞坏死和凝固变性区域内部分组织坏死等较为一致的病理特征,可以诊断为血液中有毒物质引起的脾组织病变,导致脾功能低下;肝胰组织和肾组织较脾组织病变相对较轻;肠、心、鳃、头肾组织等基本正常。研究表明,本病例全部样品均有不同程度的脾凝固变性、肝组织淤血、肾组织间质充血及其组织中血管扩张、管壁增厚的病理变化,这与体表溃疡病变无直接关联。     

饲料中不同添加剂组合对锦鲤生长和体色的影响

为研究饲料中不同添加剂组合对锦鲤Cyprinus carpio(初始体质量为195.88 g±0.98 g)生长和体色的影响,并与日本优质锦鲤商品饲料进行增重和增色效果对比,进行了增重和增色两部分试验,其中增重部分以三色锦鲤为研究对象,探讨了试验增重饲料与商品增重饲料对其生长的影响,增色部分以红白锦鲤为研究对象,探讨了试验对比饲料、试验增色饲料和商品增色饲料对其体色的影响,各组均设3个重复,试验周期为60 d,每隔15 d测定锦鲤的生长和体色指标。结果表明:添加L-肉碱、血球蛋白粉、螺旋藻和枯草芽孢杆菌的试验饲料对三色锦鲤的促生长效果与商品增色料无显著性差异(P0.05),但试验饲料具有更低的饲料系数;添加虾青素、螺旋藻和枯草芽孢杆菌的试验饲料对红白锦鲤体色的增艳效果与商品增色料无显著性差异(P0.05);投喂两种试验增色料和商品增色料的锦鲤体表各部位对色素的沉积程度相似。研究表明,采用不同添加剂组合的两种试验饲料与日本优质锦鲤饲料的功效水平相当,能够分别满足对锦鲤快速增重和增色的要求。     

饲料脂肪水平对锦鲤体色和几项免疫指标的影响

研究了在螺旋藻添加的质量分数为12%时,饲料脂肪水平（5.36%、7.74%、10.52%、12.85%和15.45%均为质量分数）对红白锦鲤Ornmmental carp幼鱼（初始体质量为5.85 g±0.19 g）体色和免疫指标的影响。每组设3个重复,每个重复组饲养10尾锦鲤,表观饱食投喂60 d。结果表明：当饲料中脂肪水平为10.52%时,试验鱼皮肤中类胡萝卜素含量显著高于其它试验组（P〈0.05）,体表红质的a＊值最高;试验鱼肝胰脏中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力随脂肪水平的升高而下降,饲料脂肪水平对碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶等免疫指标没有产生显著影响（P〉0.05）。上述研究说明,在配合饲料中添加一定量的螺旋藻时,锦鲤着色效果最好时的适宜饲料脂肪水平为10.52%,提高饲料脂肪水平不会持续提高锦鲤对螺旋藻的利用效率。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

鲤HSP90作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究

为研究鲤热休克蛋白90(HSP90)的免疫效果,根据鲤HSP90 mRNA的基因序列(GenBank),构建真核表达质粒pEGFP-C1-HSP90,并将pEGFP-C1-HSP90转染至鲤脑细胞(CCB)中,荧光倒置显微镜下观察显示,重组质粒pEGFP-C1-HSP90在CCB中成功表达;以不同免疫剂量的重组表达质粒与pIRESORF81联合免疫鲤,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫前后抗体水平。结果表明:注射重组质粒的血清中能够检测到KHV特异性抗体,其抗体水平随着免疫次数的增加而增加,第三次免疫后两周,抗体水平达到最高;联合免疫与单独免疫核酸疫苗pIRES-ORF81相比,抗体水平明显增加,但无显著性差异(P0.05)。研究表明,鲤HSP90作为锦鲤疱疹病毒的免疫佐剂具有一定的目标效果。     

β-胡萝卜素对红白锦鲤生长、体色及代谢的初步研究

通过投喂含有β-胡萝卜素为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/kg的人工配合饲料,采用光谱法,对β-胡萝卜素对450尾红白锦鲤体色的影响及其在体内的沉积部位进行了研究,并用色谱方法对β-胡萝卜素在体内的色素组分进行了研究。饲养2个月后,测定皮肤、鳞片、头、鳍条的色素吸光度值,对上述溶液进行浓缩,并薄层层析。结果表明,红白锦鲤总色素光谱在可见光区(454 nm和470 nm)有两个吸收峰,β-胡萝卜素在1.0 g/kg组的增长率、增重率、特定增长率显著高于对照组(P0.05),1.0～2.5 g/kg各组的饵料系数均显著低于对照组(P0.05);对于鲤的红白和红色区域,β-胡萝卜素的添加量为1.5～2.0 g/kg时,对红白锦鲤体色的增色效果最好;β-胡萝卜素对红白锦鲤白色区域总类胡萝卜素的含量影响很小;β-胡萝卜素在红白锦鲤体内的主要沉积部位是皮肤和鳍条;β-胡萝卜素在红白锦鲤体内主要转化为虾青素。