肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白.融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体.3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3 200.Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应.应用3株单抗均可特异性检出EHEC O157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。     

类志贺毒素II型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

猪水肿病大肠杆菌贵州分离株毒素Stx2e对Vero细胞的毒性作用

猪水肿病毒素即Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型(Shiga toxin 2e,Stx2e)。采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,比较了从患水肿病猪粪便样品中分离的28株大肠杆菌所产志贺毒素对Vero细胞的毒性作用。结果显示,MTT比色法检测的细胞比活力与AO/EB染色法检测的正常细胞与早期凋亡细胞比率之和呈正相关。将28株菌株产生的Stx2e作用于Vero细胞,均能抑制Vero细胞的生长,并诱导Vero细胞的凋亡;其中8株病原菌所产Stx2e毒素对Vero细胞的毒性作用强于O157∶H7。这些毒素的毒力差异可能与其A亚基基因的结构变异有关。结果提示,贵州分离的产Stx2e大肠杆菌的毒力存在一定差异,其中部分菌株的毒力作用较强,应加强对养殖场仔猪的保护。     

五重PCR检测大肠杆菌O157:H7菌体抗原和毒素基因

针对O157：H7大肠杆菌O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应，而单一毒素基因并不是O157：H7所独有这一特点，建立了五重和四重PCRA-法，同时检测大肠杆菌O157：H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157：H7，并有较高的特异性，解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低，并有交叉反应等问题。     

屠宰环节牛羊产品中大肠杆菌O_(157)污染状况调查

初步调查分析屠宰环节529份牛羊产品中大肠杆菌O_(157)污染状况,同时对分离出的16株大肠杆菌O_(157)进行药敏试验和致病性分析。结果表明,大型屠宰场的牛羊产品受大肠杆菌O_(157)污染程度较重为4. 42%,手工屠宰场比机械屠宰场污染程度重,为4. 27%,西北方向比西南方向污染重,达到5. 08%,羊产品比牛产品污染重,为5. 91%,出场前胴体拭子比刚宰出的污染重,达到5. 84%。16株分离菌株对常见抗生素均敏感,且这些菌株都存在肠溶血素(ehx A基因)、紧密素(eae A基因)和+93 uid A毒力基因,志贺毒素(Stx1)均缺失和志贺毒素(Stx2)部分缺失。     

一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定

在上海某猪场采集6份腹泻猪粪便样品和2份病死猪小肠内容物样品,增菌后经麦康凯培养基和伊红美兰培养基分离得到32株疑似大肠杆菌,通过PCR方法分析O157特异基因rfbE和血清学鉴定,分离获得一株肠出血性大肠杆菌O157：H7。PCR检测该菌株的毒力因子携带情况,结果表明其只携带志贺毒素Ⅱ,而不携带志贺毒素I、紧密素和溶血素等毒力因子;生化试验发现该菌株与大多数O157：H7特性不同,可分解山梨醇;毒力试验和耐药性试验表明该菌株毒性较强,且耐药性很强,对大多数抗生素不敏感。     

志贺样毒素II型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素II型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT -IIeA在含氨苄青霉素的 2×YTA培养基中培养 ,至对数生长期时加入IPTG诱导 ,诱导的重组菌超声波裂解后 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白 ,测定纯化蛋白的浓度 ,免疫BALB/c小鼠 ,细胞融合后经ELISA检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞 ,命名为A2 _D3 ,制备的单抗腹水ELISA效价为 2 4log2 ,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应 ,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测 13株水肿病菌株 ,发现均产志贺样毒素II型变异体     

五重PCR检测大肠杆菌O157∶H7菌体抗原和毒素基因

针对 O1 5 7∶H7大肠杆菌 O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应 ,而单一毒素基因并不是 O1 5 7∶ H7所独有这一特点 ,建立了五重和四重 PCR方法 ,同时检测大肠杆菌 O1 5 7∶ H7的 O抗原、H抗原和 4种毒素基因 ,可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌 O1 5 7∶ H7,并有较高的特异性 ,解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低 ,并有交叉反应等问题     

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT-ⅡeA在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白.用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为A2-D3,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗检测13株水肿病菌株,发现均产志贺样毒素Ⅱ型变异体.     

抗狂犬病病毒ERA株单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

将狂犬病病毒ERA株纯化后免疫雌性BALB／c小鼠。取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，经克隆和间接ELISA筛选，获得3株稳定分泌抗狂犬病病毒ERA株单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为c7、c4和H3。经过鉴定：其腹水效价分别为1：1×10^3、1：5×10^4及1：1×10^4；且与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）不发生交叉反应；3株单抗均为IgG类型。采用G蛋白亲和层析柱对腹水进行纯化，将纯化后的单抗腹水用FITC（异硫氰酸荧光素）标记制备荧光抗体，建立了检测狂犬病病毒的荧光染色法。结果表明，该方法对狂犬病的实验室诊断具有快速和特异性高的特点。     

禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析

以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选,获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明,8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达1∶3.2×103~1∶5.1×106,其中2株HI效价达212。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝,与减蛋综合征(EDS-76)病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)均不反应。亚类鉴定证实,除1C7单抗为IgG2b外,其他7株均为IgG1亚类。Westernblotting试验分析初步表明,8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原,其中3株针对核蛋白(NP),2株针对基质蛋白M1,2株针对血凝素HA/HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致,其中1株未明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。     

大肠杆菌O_(157)∶H)7荧光PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立大肠杆菌O157∶H7荧光PCR检测方法,试验参照Gen Bank中已发表的大肠杆菌O157∶H7的O抗原RFBE基因序列,针对保守区序列设计了特异性引物和探针,优化了反应体系和反应程序,评价了该方法的特异性、敏感性、重复性,并进行了临床样品检测。结果表明:该方法的特异性和重复性好,具有较高的敏感性,最低检测浓度为5 cfu/mL;用该方法检测60份冻肉样品,得到的结果与传统的细菌分离鉴定法一致。说明建立的大肠杆菌O157∶H7荧光PCR方法是快速鉴定大肠杆菌O157∶H7的有效方法,具有较大的应用价值。     

大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果表明,该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应,用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清,抗体效价分别为1×106和1×105,两者的敏感度相当。该试纸条操作简便,10min可出结果,适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。     

抗猪肺炎支原体特异性P36蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

表达P36基因的重组菌BL21(6P-1-P36)经诱导表达,超声波裂解后高速离心,分别收集上清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于单抗筛选;同时,用GST-P36包涵体抗原腹腔注射免疫BALB/c小鼠(400μg/只)。利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得了1株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株5A7-2。生物学特性鉴定表明,腹水单抗的间接ELISA效价为1∶2.5×106;免疫球蛋白亚类为IgG2a。免疫印迹结果显示,腹水单抗能与GST-P36融合蛋白反应而不与谷胱苷肽转移酶(GST)反应,并且在猪肺炎支原体(Mycop lasma hyopneumoniae,Mhp)蛋白36000位置也有明显的条带,说明5A7-2所分泌的是针对MhpP36蛋白的单抗。P36蛋白是Mhp种特异性蛋白,其单克隆抗体的制备,为Mhp种特异性检测方法的建立奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

A型肉毒毒素Hc基因的原核表达、纯化及单抗的制备

在大肠埃希茵中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原,是以包涵体形式存在.溶解后的包涵体溶液经过处理,用镍柱亲和层析法纯化,得到纯度约为90%的融合蛋白.利用纯化的重组抗原BoNTa免疫Balb/c小鼠,获得分泌抗BoNTa特异性的3株杂交瘤细胞株2A2、4F7和2A8,其单抗鉴定均为IgG1亚型,滴度达到1:105.高纯度和活性单抗的获得为毒素检测试剂盒的研究奠定了基础.