牛mettl3基因的原核表达与蛋白纯化

m~6A甲基转移酶(methyltransferase-like protein 3,METTL3)可调控m RNA的m6A甲基化水平,调节细胞蛋白质合成,实验室前期发现METTL3为乳腺上皮细胞乳合成重要调节分子,发挥泌乳调节作用。目前尚不清楚METTL3分子结构基础及其参与的调节机制。为揭示METTL3结构与功能关系,对METTL3蛋白作原核表达及纯化。研究采用PCR方法扩增牛mettl3基因完整CDS区,将CDS区插入原核表达载体p GEX-4T-1,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导METTL3蛋白大量表达,用8 mol·L-1尿素裂解包涵体,利用GST蛋白纯化试剂盒纯化诱导获得METTL3蛋白。SDS-PAGE证实GST-METTL3融合蛋白存在于包涵体内,试验获得高纯度GST-METTL3融合蛋白,为进一步研究METTL3蛋白在奶牛泌乳中作用提供重要依据。     

牛NF-κB1基因的原核表达与蛋白纯化

NF-κB1是一类重要核转录因子,参与多种基因表达调控。NF-κB1能与奶牛乳腺中乳合成调控相关基因结合,发挥泌乳调节作用。研究应用PCR方法扩增奶牛NF-κB1基因编码序列,通过Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体中,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-NF-κB1,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经酶切和测序鉴定正确后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,8 mol·L~(-1)尿素裂解包涵体,裂解后上清经GST-Sepharose 4B亲和纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-NF-κB1构建成功,SDS-PAGE证实NF-κB1融合蛋白存在于包涵体内,纯化后得到GST-NF-κB1融合蛋白,为进一步研究NF-κB1蛋白在奶牛泌乳中作用提供试验依据。     

水稻抗白叶枯病基因 xa5的原核表达及蛋白纯化

水稻是重要的粮食作物,其产量高低与病虫害等因素密切相关,由黄单胞杆菌引起的水稻白叶枯病是导致水稻产量减少的主要病害之一。控制白叶枯病最安全、经济有效的方法是培育抗病品种,隐性抗病基因xa5是重要的水稻白叶枯病抗性基因。通过构建显性及隐性xa5基因的原核表达载体(PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5),转化大肠杆菌BL21,经0.2 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h,表达显性Xa5和隐性xa5蛋白;结合western-blotting分析,结果表明表达的蛋白是带有GST标签的融合蛋白,最后利用谷胱甘肽亲和层析柱将蛋白纯化,为后期研究xa5基因的功能提供基础。     

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

杜仲EuGT4基因原核表达及其编码蛋白纯化

为进一步研究杜仲糖基转移酶结构和功能提供科学依据,利用贵州省农业生物工程重点实验室构建的杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)基因组数据库注释信息,从杜仲克隆得到1个全长为1 461bp的糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)cDNA序列,将该基因命名为EuGT4;利用基因重组技术构建原核表达载体pET30a-EuGT4,遗传转化大肠杆菌BL21(DE3);在37℃条件下,以终浓度为0.2mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16h,并采用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化蛋白,以15%SDSPAGE凝胶电泳定性分析。结果表明:EuGT4重组蛋白以包涵体形式在BL21(DE3)中表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测和Western Blot鉴定,在相对分子质量约50kD处有1条特异性蛋白条带,确定为杜仲EuGT4蛋白。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

绵羊eIF3h基因克隆、原核表达及蛋白鉴定

【目的】克隆绵羊真核翻译起始因子eI F3h,构建原核表达载体,并诱导外源蛋白表达,检测、鉴定带有His标签的目的蛋白。【方法】根据Genbank中绵羊eI F3h基因CDS序列设计引物,PCR特异扩增DNA片段,酶切、连接至pE T28α(+)载体,将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株中诱导eI F3h蛋白表达。采用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况,利用Western blot技术检测、鉴定目的蛋白。【结果】正确、完整的克隆到绵羊eI F3h基因CDS区序列,片段全长1 059 bp。将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株后,在37℃,1 mmol/L浓度的IPTG诱导3.5 h后获得以包涵体形式存在的目的蛋白,分子量大小约为40 kD。【结论】获得了完整、正解的绵羊eI F3h基因CDS区序列片段,构建了该基因的原核表达载体,成功诱导了绵羊eI F3h基因外源表达的目的蛋白,为绵羊eI F3h基因的后续研究提供了科学数据。     

烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化

[目的] 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道.为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础.[方法] 采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟(Nicotia...     

柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.     

草胺膦抗性基因bar的原核表达与蛋白质纯化

通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。     

牛尿酸氧化酶基因的原核表达载体构建与表达研究

为了研究牛尿酸氧化酶(urate oxidase; EC 1. 7. 3. 3)的原核表达并优化表达条件,构建pETUO尿酸氧化酶原核表达载体,优化牛尿酸氧化酶的原核表达条件,对表达的尿酸氧化酶的活性进行测定.结果显示,表达的牛尿酸氧化酶大小为34 ku.在42℃的最适温度下,测定该酶活力达到9 U·mL-1.文中对原核表达牛尿酸氧化酶的意义做了进一步的探讨.     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

叶锈菌侵染诱导产生的小麦Wrab17蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病是影响世界小麦生产的重要病害之一。研究小麦抗叶锈相关防卫蛋白的表达,对于深入研究小麦对叶锈菌的抗病机制,更好地为农业生产服务,具有重要意义。Wrab17(Wheat response to ABA)是一个冷胁迫诱导蛋白,前期工作通过构建叶锈菌侵染早期的小麦SSH文库及ESTs序列分析,筛选到Wrab17基因在不亲和组合接种后早期显著上调表达,初步表明Wrab17基因可能参与了小麦抗叶锈菌侵染过程,这是首次发现Wrab17参与抗病反应。本研究进一步利用RT-PCR技术从接种叶锈菌的小麦叶片中克隆获得了Wrab17基因的CDS区,构建了Wrab17蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达Wrab17蛋白。利用镍柱亲和层析方法获得了纯度较高的重组蛋白,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,得到特异性较好的多克隆抗体。为进一步通过Western Blotting技术检测Wrab17在小麦被叶锈菌侵染后不同时间点表达量的变化,明确Wrab17参与小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应奠定基础。     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

牛Cathelicidin BMAP-28基因的克隆及原核表达

根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...