共查询到18条相似文献,搜索用时 78 毫秒
1.
为实现对山羊痘病毒(GTPV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及PPRV的M基因,分别设计合成两套特异性引物及探针;探针分别用5'-FAM-TAMRA-3’及5'-JOE-Eclipse-3'标记物进行标记以实现同步检测.结果显示,所建立的ITR-M二联探针荧光定量RT-PCR方法可同时特异性检测GTPV和PPRV产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒、犬瘟热病毒等相关病毒无荧光信号可检出.以GTPV-ITR和PPRV-M的pMD-18T载体质粒为标准品,构建了双重标准曲线,ITR M探针的检测敏感度可分别达103拷贝/μL及101.2拷贝/μL cDNA.本研究初步建立了可同步快速检测GT-PV和PPRV的二联实时荧光定量RT-PCR法. 相似文献
2.
本试验旨在建立一种快速、灵敏的诊断小反刍兽疫的方法。本研究通过RT-PCR方法扩增小反刍兽疫病毒N基因,连接到pMD19-T克隆载体上,构建质粒标准品。根据GenBank中中国流行毒株及Nigeria 75/1疫苗株N基因保守序列设计引物,利用SYBR Green Ⅰ法进行实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果表明,在2.82×100~2.82×107拷贝/μL范围内,Ct值与质粒拷贝数对数值呈良好的线性关系,标准曲线线性关系R2值为0.992;其他病毒无特异性扩增曲线,特异性良好;批内变异系数为0.27%~2.77%,批间变异系数为0.41%~3.39%,重复性较好;检测灵敏度可达2.82拷贝/μL,是普通PCR的1 000倍。用该方法对12份cDNA样品进行检测,9份为阳性,3份为阴性,而普通PCR检测,7份为阳性,5份为阴性,说明本方法比普通PCR灵敏度高。本检测方法的建立对快速、灵敏诊断小反刍兽疫,防止疫情的扩散具有重要意义。 相似文献
3.
一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 总被引:1,自引:3,他引:1
建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。 相似文献
4.
5.
为建立一种灵敏、准确、快速的山羊痘病毒(GTPV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)双重PCR检测方法,根据GenBank上登录的GTPV、PPRV两种病毒的基因序列设计检测引物,在常规PCR基础上,对反应条件及反应体系进行优化,建立了这两种病毒的双重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性检验。结果显示:仅GTPV和PPRV核酸样品扩增出与预期目标相符的目的片段,而其他病原对照均未出现目的条带;GTPV的最低检出量为0.283 ng/μL,PPRV的最低检出量为6.459 ng/μL。结果表明,本研究建立的双重PCR检测方法可一次性同时完成PPRV、GTPV两种病原的检测,且具有较高的特异性和敏感性。本方法的建立为山羊痘和小反刍兽疫的临床诊断、流行病学研究、疫情监测提供了技术支持。 相似文献
6.
7.
8.
9.
10.
《中国兽医学报》2016,(4):572-578
山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。 相似文献
11.
12.
本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳(N)蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。 相似文献
13.
为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。 相似文献
14.
研究小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H 蛋白生物学活性,为建立PPRV 抗体检测方法提供材料。根据 GenBank 已发表的 PPRV H 蛋白质序列,设计上、下游引物,以 PPRV核酸为模板进行 PCR 扩增,扩增产物克隆至 pET52/LIC 载体中,构建了 pET52/LIC-PPRV H 表达载体。将 pET52/LIC-PPRV H 重组质粒转化大肠埃希菌 BL21(DE3)进行融合表达,经 SDS-PAGE 电泳分析,可见 PPRV H 蛋白成功得到了表达,融合蛋白的分子质量约为75 ku,Western blot 分析表明所表达的重组蛋白可与 PPRV 阳性血清发生特异性反应,说明表达的 PPRV H 蛋白可以作为建立 PPRV 抗体检测的蛋白。 相似文献
15.
16.
17.
针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99~104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。 相似文献
18.
为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。 相似文献