转基因猪研究的回顾及今后发展方略之我见

简要回顾了20多年来国内外转基因猪的研究,在对猪生产性能的遗传改良、用猪作为生物反应器生产医用蛋白以及用猪作为异种器官移植的供者等方面．取得的一些重要进展：概述了原核注射法、精子介导法、逆转录病毒感染法和体细胞核移植法转基因技术的建立和发展历程：对转基因猪的遗传稳定性进行了讨论。并根据国内外发展的态势和我国养猪业的现状．提出了转基因猪研究方向和技术路线的发展方略．     

牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。     

体细胞核移植技术的影响因素

正体细胞核移植是近年来人类在发育生物学和细胞生物学领域所取得的最强大的成果之一,然而该项技术成功率低,技术研究薄弱,因此,分析体细胞核移植技术存在的问题,成为近年来体细胞核移植技术的研究重点。本文分析影响核移植成功率的影响因素。自1997年英国科学家Wilmut拉开了体细胞核移植时代的序幕以来,先后在小鼠、牛、山羊、猪、猫、兔等动物上获得成功。尽管体细胞核移植在理论研究和技术完善方面取得了长足的进步,但克隆效率低的瓶颈依然无法突破。     

鱼类细胞核移植研究的进展及意义

细胞核移植技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大。文章介绍了中国和世界上鱼类细胞核移植的研究成果及其最新进展;综述了鱼类细胞核移植的基本程序、方法和影响因素,包括胞质受体的准备、核供体的制备、核移植和核质杂种的培养。并对鱼类细胞核移植的应用、现存问题及应用前景进行了讨论。     

咖啡因对奶山羊成纤维细胞及奶山羊-鼠异种重构胚抗氧化性的影响

<正>近几年来,对于细胞核移植技术,细胞介导转基因技术的探索与发展是社会上研究热点之一。此技术不仅能够精确改良动物的基因型,而且比传统育种方法更为有效。通过同种体细胞核移植已经成功获得了很多转基因动物,但异种核移植胚胎发育率较低。胎儿皮肤成纤维细胞较容易分离及培养,适合用做核移植供体细胞并能够生产出各种转基因动物[1-4],而且也已经构成生产转基因动物应用体系。自由基是机体氧化反应中产生的有害物质,具有强氧化     

猪器官异种移植研究进展

随着临床医学的发展和免疫抑制剂的开发利用,同种器官移植已获得显著成效,但器官资源缺乏严重阻碍其广泛应用,因而异种器官移植受到高度重视,目前认为猪是较理想的异种器官来源。文章阐述了猪器官异种移植中的免疫障碍以及克服排斥策略、免疫耐受在异种移植中的应用、异种移植存在的生理活动障碍等问题,同时提出加强对转基因猪作为异种器官移植模型的研究,并尽快出台和完善异种器官移植相关伦理法规和指导原则等建议。     

转基因猪研究新进展

由于猪既是重要的经济动物,又是常用的实验动物,并且因为其解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类相似,因此转基因猪的研究意义重大。纵观转基因猪的发展历史,关键核心技术包括显微注射技术、体细胞核移植技术、精子载体技术、胚胎干细胞介导技术、病毒转染技术、基因打靶、ZFN技术和TALENS技术。科学家们通过这些技术对猪进行了大量研究,已经在生命科学领域取得了令人欣慰的成就。     

猪体细胞克隆技术研究进展

克隆不仅可以保护濒危动物,而且与干细胞工程技术结合应用于克隆性治疗,具有重大的科学意义和应用价值。体细胞克隆猪因其在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力,已成为当今研究的热点,但是体细胞核移植技术仍存在许多问题,其中最主要的是体细胞核移植的环节多,克隆效率低。对体细胞克隆猪的关键环节,即供核细胞、卵母细胞、显微操作、克隆胚的激活、培养及移植技术进行了简要综述。     

卵丘颗粒细胞核移植克隆猪的初步研究

经颗粒细胞核移植已成功获得克隆小鼠(Wakayamaetal.1998,Nature394:369)。在牛,卵丘颗粒细胞核移植胚胎也已经发育到囊胚期(Collasetal.1994,MolReprodDev38:264)。然而,目前在猪尚未见到有关颗粒细胞核移植成功的报道。为此,我们进行了颗粒细胞核移植培育克隆猪的研究。...     

猪体细胞克隆研究进展

综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明:卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率(82.9%)和桑葚胚率(55.9%)均高于胎儿成纤维细胞卵裂率(75.7%)和桑葚胚率(48.7%),但差异不显著(P>0.05);卵丘细胞作供体时的囊胚率(19.7%)则高于胎儿成纤维细胞(11.0%),差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明:供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率(75.6%)与供体不饥饿的卵裂率(75.8%)差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率(46.5%)和囊胚率(11.0%)高于供体不饥饿的桑葚胚率(39.3%)和囊胚率(9.0%),但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10?S和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明:用CR1aa液培养时,添加10?F,其囊胚率(9.1%)高于添加10?S(4.2%)(P>0.05);用SOF液培养时,添加10?F,其囊胚率(11.2%)高于添加10?S(5.5%)(P>0.05)。说明用SOF液优于CR1aa液。     

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用.本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495).囊胚发育率差异显著(p＜0.05).试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTEs的贴壁率差异显著(p＜0.05).以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能.     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。     

芸薹属栽培种与近缘种的远缘杂交及进展

芸薹属栽培种的众多近缘种是其遗传改良的宝贵种质资源,可提供许多有用的性状及基因。在过去的几十年中,研究者通过有性杂交和原生质体融合的方法,合成了许多远缘杂种及后代材料、异源胞质雄性不育系,极大地促进和丰富了芸薹属栽培种的遗传研究与育种工作。     

体细胞核移植技术生产转基因猪胚胎的研究

以转染绿色荧光蛋白基因的猪胎儿成纤维阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,体外成熟卵母细胞为核移植受体构建绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,研究供核细胞的处理、注核部位及重构胚融合/激活时间对转GFP克隆胚早期发育的影响.结果显示,胎儿成纤维细胞血清饥饿与非饥饿培养10 d处理组,采用卵周间隙核移植重构胚的卵裂率（82.35%和79.07%）差异不显著(P >0.05);体外培养42~44 h 卵母细胞进行胞质内和卵周间隙注核的重构胚胎,其卵裂率（81.11%和76.80%）差异不显著（P >0.05）;将卵周间隙注射法构建重构胚在0~1 h,2~4 h 和6~8 h 进行融合/激活操作,前2组重构胚卵裂率（75.61%和83.07%）无显著差异(P >0.05),但显著高于第3组（60.00%）的卵裂率(P <0.05).     

植物水平基因转移研究进展

水平基因转移,一般分为细胞内部或者跨越物种边界的遗传物质交流。跨界直接介导方式,包括共生、内共生、寄生、嫁接等。细胞内的基因转移,主要包括细胞核与细胞器基因组间的相互渗透;跨越物种边界的遗传物质交流,主要涉及寄生与寄主植物的基因横向转移,寄主与寄生植物mRNA也会发生大规模的水平转移。基于基因组学研究进展,本研究综述了植物水平基因转移的迁移序列类型、迁移方向及迁移机制:首先,植物细胞的线粒体基因组能够整合细胞核转座元件以及叶绿体起源的tRNA基因,线粒体和叶绿体基因组的功能基因及间区序列能够迁移到核基因组;其次,植物种间,通过寄生、嫁接等方式转移大量的DNA(如线粒体基因、叶绿体基因和转座元件)和RNA(如mRNA)序列;迁移机制涉及到DNA介导和RNA介导方式,迁移方向包括单向和双向转移。迁移序列的基因功能活性研究是重要的后续研究方向。     

中介语的语用失误解析

本文运用语言的共性理论和标记性理论，通过对比中西文化和认知方式的差异，分析了语言语用失误和社交语用失误的成因，指出在中介语的形成过程中应注重词汇的理性意义和附加意义，有意识的进行文化导入，减少母语的负迁移，以促进中介语的发展     

乳源木莲混交林种内及种间竞争研究

利用单木竞争指数模型 ,研究富口和黄坑乳源木莲种内和种间的竞争强度的大小 ,结果表明 :间伐时间的不同 ,对乳源木莲种内与种间竞争强度影响很大 ,富口和黄坑种间竞争均大于种内竞争 ,但黄坑的乳源木莲种内和种间的竞争强度均大于富口 .竞争指数与对象木胸径符合幂函数关系 ,并达到显著水平 ,乳源木莲种内、种间及整个林分的竞争强度随着对象木胸径的增大而下降 ,并维持在较低的水平     

供核细胞来源对猪克隆胚胎发育的影响

为研究不同组织来源的供核细胞对猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响,分别采用颗粒细胞、耳成纤维细胞和尾成纤维细胞作为供核细胞,移入体外成熟的猪去核卵母细胞中形成重构胚,培养后对比其卵裂率和囊胚率。结果表明：以耳成纤维细胞作为供核细胞的重构胚的囊胚率最高,为17．8％,显著高于颗粒细胞（11．4％）（P〈0．05）。在卵裂率方面,两者无显著差别,分别为65．6％和61．9Voo（P〉o．05）。猪尾尖成纤维细胞的发育能力最差,卵裂率仅为20．2％且未获得囊胚,与其它两组差异显著（P〈O．05）。因此,耳组织来源的成纤维细胞作为供核细胞组织来源丰富且细胞易于传代和保存,以此为供核细胞的重构胚发育能力强,适合作为供核细胞。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。