甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

矮牵牛RCW基因的克隆及功能分析

花色是植物的重要性状,其形成受多种因素影响。为了进一步解析矮牵牛花瓣呈色的分子机制,我们以生物信息分析、基因克隆、基因表达分析、基因沉默等技术,在矮牵牛中克隆和鉴定了一个影响花瓣呈色的基因RCW。不同矮牵牛组织中进行表达分析表明,该基因在雄蕊、雌蕊、花瓣、叶片、根、茎、萼片中都表达,但是在花瓣中的表达随着花瓣发育逐渐增强;并且受到AN1、AN11、PH3等转录因子的调控。在矮牵牛品种M1×V30中进行RNAi沉默RCW基因的表达,其花瓣中的pH值与对照相比明显降低,花瓣呈现更深的紫色。对RCW编码的蛋白进行亚细胞定位发现其位于内质网、高尔基的膜系统上,表明其可能参与pH相关蛋白的转运过程。因此,RCW基因在矮牵牛花瓣细胞中的功能,主要是通过参与pH相关蛋白的转运,调控花瓣液泡中的pH环境,从而影响花瓣的呈色过程。本研究为全面揭示矮牵牛花瓣呈色的分子机制提供了重要依据,并为今后通过分子育种手段改变植物花色提供了理论基础。     

甘蔗割手密种糖转运蛋白基因SsSWEET11的克隆与功能分析

SWEET蛋白通过调控植物体内糖分的运输、分配、转化和贮藏,广泛参与植物生长发育及响应病原菌胁迫的生理生化过程。为揭示SWEET基因在甘蔗生长发育及其与赤条病菌互作中的生物学功能,本研究基于甘蔗割手密种全长转录组文库和比较基因组学,根据注释SsSWEET11基因序列设计特异引物,利用RT-PCR技术从甘蔗割手密种cDNA文库中扩增该基因的全长序列,运用多种生物信息工具分析其特征,构建系统进化树;采用不同组织和抗、感赤条病的甘蔗品种分析SsSWEET11的表达模式;利用瞬时表达和亚细胞定位分析SsSWEET11的功能。结果表明,从甘蔗割手密种克隆获得SsSWEET11基因(登录号为OP554214),该基因全长927bp,编码308个氨基酸残基,具有2个MtN3＿saliva结构域和7次跨膜结构域。系统进化树分析显示,SsSWEET11属于SWEET蛋白家族第Ⅲ亚家族成员,与高粱SbSWEET11相似性高达97.41%。qRT-PCR分析表明, ShSWEET11基因在不同组织中组成型表达,在蔗叶和根中表达量显著高于其他组织;赤条病菌胁迫下,ScSWEET11基因在抗病品种ROC22和感...     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

大豆GmNF-YC2基因的克隆与功能分析

NF-Y (nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物, 是由3个不同的亚基(A, B, C)组成, 并通过作用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。本文从大豆KN18中克隆大豆NF-YC基因GmNF-YC2, 并且利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其表达模式, 发现GmNF-YC2的表达受光调控, 并在开花期第3复叶中表达量最高。结果表明, GmNF-YC2在大豆光周期开花调节中起重要作用。拟南芥原生质体瞬时表达实验证实, GmNF-YC2蛋白定位在细胞核中。这为大豆NF-YC家族基因的功能研究提供重要依据。     

甘蔗赤霉素氧化酶基因ScGA20ox1的克隆及功能分析

GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)是赤霉素(gibberellic acid,GA)合成过程中的关键限速酶,但甘蔗GA20ox1基因(ScGA20ox1)的功能及其表达模式尚未明确。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了甘蔗GA20-氧化酶基因(ScGA20ox1), ScGA20ox1基因全长1574 bp,含有一个1125 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码375个氨基酸。ScGA20ox1蛋白分子量为42.3 kD,理论等电点为5.95,不含信号肽,不含跨膜结构域,为可溶性蛋白。实时荧光定量PCR结果表明该基因在甘蔗幼苗中茎秆的表达量最高,叶片次之,根的表达量最低;干旱、低温和赤霉素处理均会改变该基因在不同组织的表达模式。利用农杆菌介导法转化拟南芥,获得过表达ScGA20ox1的转基因拟南芥植株,转基因拟南芥植株存在株高增高,节间长度增长的表型变异。本研究结果表明,ScGA20ox1参与甘蔗的生长发育并在响应非生物逆境中发挥重要调控作用,过表达转基因拟南芥形态发生变化,这为深入探究ScGA20ox1生物学功能,...     

甘薯抗旱相关基因IbNAC72的克隆与功能分析

NAC(NAM/ATAF/CUC,NAC)转录因子是植物中特有的转录调控因子,在植物体的生长发育与逆境胁迫响应等多种生理过程中起着重要的调控作用。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从甘薯品种栗子香中克隆到甘薯抗旱相关基因IbNAC72,该基因cDNA长为1319bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1008 bp,编码335个氨基酸,分子量为37.4 kD,等电点为8.76,基因组全长为1199 bp,含有3个外显子、2个内含子。多重序列比对和系统进化树分析显示, IbNAC72基因与牵牛花中同源基因的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,IbNAC72基因在甘薯叶片中的表达量显著高于在茎段和根系中;同时Ib NAC72基因受到干旱和盐胁迫显著诱导表达。利用农杆菌介导法转化烟草,获得过表达IbNAC72基因的转基因烟草植株。对IbNAC72转基因烟草植株的抗旱性分析表明,在长时间干旱条件下,转基因植株的根系更加发达, SOD活性显著提高, MDA的含量显著降低,抗旱性显著提高...     

基于转录组及WGCNA的甘蔗干旱响应调控网络分析

干旱是制约甘蔗产业发展的重要因素之一。前人研究表明,斑茅具有良好的抗性基因,可以通过远缘杂交遗传给后代。本研究以斑茅与甘蔗杂交F1代无性系YCE96-40为材料,对苗期干旱处理0 h和24 h后的叶和根进行转录组测序分析,比较了根和叶在转录水平上响应干旱的差异,鉴定出21,885个(DR vs CR:10176, DL vs CL:7907)差异表达基因(DEGs),根中差异表达基因多于叶中,说明根对干旱胁迫响应更为剧烈。GO功能富集分析发现,根和叶中DEGs均富集到与脱水反应相关及激素信号转导过程相关的条目,比如“对渗透胁迫生物过程的响应”和“对缺水生物过程的反应”等。与叶不同的是,根中大量DEGs显著富集到与细胞膜相关的条目。在根中鉴定出多个木质素相关DEGs,表明木质素参与了根的干旱响应。通过对所有DEGs进行WGCNA分析,共鉴定出11个基因共表达模块,其中与干旱处理后的根显著相关有5个模块,与干旱处理后的叶显著相关的有2个模块。进一步筛选出了26个转录因子为甘蔗干旱响应的候选转录因子,构建了调控网络。研究结果为进一步理解甘蔗抗旱性的分子机制及甘蔗抗旱性育种提供了理论指导。     

甘蔗割手密种NAC转录因子ATAF亚家族鉴定及栽培品种ScNAC2基因的功能分析

NAC (NAM, ATAF和CUC)是陆生植物特有的转录因子家族,包含18个亚家族,其中ATAF亚家族成员广泛参与生物和非生物胁迫应答过程。本研究基于甘蔗割手密种基因组数据和栽培品种ROC22的cDNA文库,首先,通过比较基因组学方法,对ATAF亚家族成员进行鉴定、蛋白多序列比对、系统进化分析及启动子区域顺式作用元件预测;其次,从甘蔗栽培品种克隆获得割手密种ATAF亚家族成员SsNAC2的同源基因ScNAC2,在生物信息学分析基础上,采用qRT-PCR技术分析该基因的组织特异性表达模式,及其在不同外源胁迫下的表达特性;最后,对ScNAC2基因的编码蛋白进行亚细胞定位和转录激活活性试验。结果表明,一共鉴定到6个ATAF亚家族成员,开放读阅读框在889～1017bp之间,相对分子量介于32.067～35.819kD之间,理论等电点分布在5.09～8.92之间,所有成员的编码蛋白被预测均定位于细胞核上。这些基因的Ka/Ks比值均小于1,表明纯化选择在进化过程中起重要作用。蛋白的氨基酸序列比对显示,ATAF亚家族成员都含NAM保守结构域(由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ亚结构域组成)。系统进化分析揭示,...     

甘蔗中一个NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析

采用RACE技术, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376中克隆了一个NBS-LRR类基因的cDNA全长序列, 命名为SNLR。生物信息学分析显示, 甘蔗SNLR基因的cDNA全长为2 985 bp (Accession No. EF155654), 包括一个2 661 bp的完整开放读码框以及一个典型的29 bp poly-A。同时, 还具有NBS-LRR类抗病基因的所有保守结构域, 包括4个NBS区域保守结构域和6个潜在LRR结构域;蛋白疏水性分析和二级、三级结构分析表明, 该基因编码的蛋白质为弱碱性蛋白, pI为7.76, 无明显的疏水结构域, 以卷曲结构和螺旋结构为骨架, 三级结构未见明显的跨膜信号蛋白区。定量PCR分析表明, 甘蔗SNLR基因的表达受到黑穗病菌、水杨酸和过氧化氢的影响, 分别表现出“抑-扬”、“全程抑制”和“扬-抑”的表达模式, 也具有抗病基因组成型和组织特异性表达的特点。推测甘蔗SNLR基因可能为抗病相关基因。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

小麦TaPLD-2基因的克隆及功能分析

为了寻找耐盐新基因,培育耐盐新品种。本研究以23个小麦品种为材料,对TaPLD-2基因进行克隆及序列多态性分析,并对TaPLD-2基因响应盐胁迫表达模式进行了研究。结果表明,TaPLD-2基因的全长编码框为1301 bp,位于2DS染色体上,编码的蛋白定位于细胞质,为亲水蛋白,无跨膜区域,属于可溶性NAD(P)(H)氧化还原酶家族;TaPLD-2基因受盐胁迫诱导上调表达,表达量在盐胁迫24 h为对照组的1.8倍,48 h达到最高,为对照组5倍。分析表明SNP位点与相对根长、相对株高及K⁺、Na⁺含量都存在一定程度的相关性。     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。     

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。     

玉米ZmGRAS31基因的克隆及功能研究

GRAS 蛋白家族是一类植物特有的转录调控因子,在多种植物中均有报道。为了探究玉米 GRAS 基因家族在逆境胁迫下的功能,本研究从玉米根中克隆获得 ZmGRAS31 (AC: NC_024462),该基因全长 1422 bp,编码 473 个氨基酸。生物信息学分析表明 ZmGRAS31 蛋白分子量为 51,700.38 Da,理论等电点为 4.73,具有 GRAS 转录因子家族特有的保守结构域,但不具跨膜结构,亲水性较差。玉米原生质体瞬时表达实验表明 ZmGRAS31 定位于细胞核内。实时荧光定量 PCR (qPCR)分析表明,在低温、脱水、高盐、干旱处理下, ZmGRAS31 在玉米幼苗均上调表达;不同浓度NaCl 处理过表达 ZmGRAS31 转基因拟南芥植株,其根长优于野生型,由此推测该基因可能参与玉米非生物胁迫应答。     

栽培小麦Brock中抗白粉病相关基因TaRPP13-1B的克隆及功能分析

白粉病是小麦生产中的主要病害之一,发掘抗病基因并实现抗病基因转育是提高作物抗病性的最经济有效的方法。本研究克隆了一个位于小麦染色体1B上、具有典型CC、NBS和LRR结构域的基因TaRPP13-1B。接种白粉菌后, TaRPP13-1B基因在抗病小麦Brock和BJ-1中表达量虽然出现上下调波动,但平均表达水平一直高于感病小麦品种京411。采用病毒诱导的基因沉默和转基因过表达技术进行功能分析,发现抑制目标基因表达,抗病小麦品种Brock对白粉菌的抗性显著降低;过表达TaRPP13-1B的转基因小麦津强5号对白粉菌抗性明显提高。说明TaRPP13-1B基因参与小麦抗白粉病的防御反应过程。该研究为小麦抗病品种的选育提供了有价值的备选基因。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。