香蕉trihelix转录因子MaGTL1a的分离及特性

【目的】研究香蕉MaGTL1a转录因子的特性及其基因表达规律,探讨MaGTL1a转录因子在香蕉果实成熟过程中的作用。【方法】以香蕉果肉c DNA为模板,采用RT-PCR获得MaGTL1a序列;利用烟草瞬时表达法和酵母系统分析MaGTL1a亚细胞定位和转录调控活性;通过实时荧光定量PCR分析MaGTL1a在香蕉果实成熟过程中的表达;运用烟草BY2悬浮细胞瞬时表达法研究MaGTL1a启动子活性。【结果】MaGTL1a c DNA序列含有1个2 283 bp的开放阅读框,编码761个氨基酸,属于trihelix转录因子的GT-2亚家族;亚细胞定位和转录活性分析显示,MaGTL1a定位于细胞核,并在酵母和植物体内具有转录激活活性;实时荧光定量PCR和启动子活性试验表明,MaGTL1a转录水平和启动子活性均受乙烯诱导,并且MaGTL1a转录水平随着香蕉果实的成熟进程而明显增强。【结论】MaGTL1a是一个受乙烯诱导和核定位的转录激活子,可能参与了香蕉果实成熟的调控。     

香蕉MaTIFY1转录因子特性及其在成熟过程中基因表达分析

从香蕉果实中分离获得1个TIFY亚族的转录因子基因,命名为MaTIFY1。该基因含有一个681 bp的ORF,编码一条长度为227 aa,分子量为24.97 kD,等电点为7.85的氨基酸多肽链。MaTIFY1定位于细胞核,并且具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MaTIFY1随着香蕉果实成熟进程表达明显增强,并且外源丙烯处理可诱导其表达。此外,MaTIFY1启动子活性受乙烯利诱导激活,进一步表明MaTIFY1可能参与香蕉果实成熟的调控。原核表达并纯化了MaTIFY1重组蛋白。     

MdMYB1转录因子调控红星苹果果实着色的计算机模拟分析及表达验证

 从‘红星’苹果(Malus domestica‘Delicious’) 果实中克隆获得了MdMYB1基因, 通过生物信息学分析( in silico analysis) 和活体细胞融合蛋白荧光观察, 确定其编码蛋白定位于细胞核。同时, 克隆了MdDFR和MdUFGT基因的启动子, 模拟分析表明2个基因的启动子序列中含有MYB结合的顺式作用元件。为了探讨MdMYB1转录因子是否调控MdDFR和MdUFGT基因的表达, 对不同光照条件下果皮花青素含量和基因表达进行了检测, 结果表明光照能够诱导花青素积累, 并迅速启动3个基因表达, 且3个基因表现出高度相似的表达模式, 表明MdMYB1转录因子可能直接调控MdDFR和MdUFGT基因的表达。     

番木瓜诱导型基因CpPGIP2启动子的克隆与分析

【目的】获得诱导型基因Cp PGIP2启动子,并分析该启动子的功能。【方法】以番木瓜Cp PGIP2基因c DNA序列(HQ660394)搜索番木瓜基因组DNA序列,获得一段约2 000 bp的5’端上游DNA序列(ABIM01005077),参照该序列设计PCR特异引物,以番木瓜叶片DNA为模板克隆该启动子,并进行生物信息学分析。将3个启动子片段替换p CAMBIA1301载体中的Ca MV 35S启动子,构建缺失启动子表达载体,以GUS瞬时表达检测缺失启动子表达活性。【结果】获得了Cp PGIP2起始密码子上游长为1 981 bp的调控序列,经分析该序列含有真菌、脱落酸、赤霉素、光照等多种响应元件,为诱导型启动子。构建了1个启动子全长表达载体和2个5’端缺失启动子表达载体,分别命名为p D0-1981、p D1-1204和p D2-261。启动子在番木瓜果肉中的瞬时表达显示,长度为1 204 bp的启动子表达活性最强。并且,该启动子在根、茎、叶、果肉和愈伤组织中均有不同程度的表达,在近外果皮的果肉处和根部表达最明显。【结论】本研究获得了Cp PGIP2启动子序列,确定了表达活性最强的启动子长度,初步分析了启动子的表达模式和顺式作用元件,为进一步深入研究Cp PGIP2基因功能以及将该启动子应用于植物基因工程育种奠定了基础。     

转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的功能分析

[目的]研究NAC转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的作用.[方法]根据前期果实成熟过程中的蛋白组数据,以八倍体红颜草莓为试材,克隆FaNAC56基因及其启动子.在蛋白水平,利用MEGA构建FaNAC56系统进化树,并通过生物信息学预测其编码蛋白的二级结构,以及利用烟草进行亚细胞定位;在转录调控水平,利用预测网站分析FaNAC56启动子区顺式作用元件以及下游靶基因,并通过RT-qPCR分析FaNAC56的时空表达模式.最后,利用果实圆片温育方法分析FaNAC56基因受外源激素诱导情况.[结果]FaNAC56基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,具有NAC转录因子NAM保守结构域.系统发育分析表明FaNAC56与月季NAC56同源性最高.亚细胞定位显示FaNAC56定位于细胞核内.FaNAC56在果实中高度表达并随果实成熟表达量急剧增加.FFaNAC56启动子区含有ABA、赤霉素、生长素、乙烯等激素和胁迫相关响应元件,其表达水平受这些激素诱导.靶基因分析发现FaNAC56可能响应多种激素、花色苷和蔗糖调控元件.[结论]FaNAC56可能通过多种激素调控草莓果实的发育和成熟.     

梅花PmMYB21在花丝伸长过程中的功能与表达调控分析

MYB21是调控雄蕊花丝伸长的关键转录因子。以梅花（Prunusmume）早花品种‘粉红朱砂’与晚花品种‘早绿萼’的花芽为材料，分别克隆得到两个序列完全一致的PmMYB21。序列分析表明PmMYB21蛋白含有MYB转录因子的R2R3保守结构域，系统进化分析表明PmMYB21与其他物种的MYB21有较高的同源性，亚细胞定位结果显示其位于细胞核内。PmMYB21的表达水平在两个梅花品种开花过程中随花丝伸长而升高；相对于晚花品种，早花品种表达上调时间显著提前。在两个梅花品种的PmMYB21启动子–1 529～–1 243 bp区域中均检测到CG序列型的甲基化水平下调，该区域甲基化水平与PmMYB21的表达量呈负相关；并在此区域检测到脱落酸、赤霉素和光响应元件，推测这些调控过程可能受到甲基化修饰的影响。加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果显示，5296个差异表达基因与Pm MYB21具有连通性，显著富集于激素响应等生物过程。结合WGCNA筛选结果和表达趋势分析，预测Pm MYB21介导生长素（IAA）、赤霉素（GA）和茉莉酸（JA）等激素的信号转导，进而参与梅花花丝的伸长。     

香石竹DcERF-1转录因子对切花衰老的负调控作用

以香石竹（DianthuscaryophyllusL.）为材料，克隆得到1个ERF转录因子基因，命名为DcERF-1。氨基酸序列比对及系统进化树分析发现，DcERF-1与拟南芥AtERF-1的同源性最高，属于Ⅸ（B3）亚组。实时荧光定量PCR显示，DcERF-1表达量在花中最高，且在花瓣自然衰老和乙烯诱导的衰老过程中都呈现先上升后下降的趋势。DcERF-1定位于细胞核中。DcERF-1在香石竹花瓣中瞬时过量表达后，花瓣褪色速度明显延缓，离子渗透率明显降低；DcERF-1被瞬时沉默后，花瓣褪色速度显著加快，离子渗透率显著升高，衰老标志基因Dc SAG12表达量显著上调。酵母单杂交试验证明乙烯信号转导途径核心转录因子DcEIN3能直接结合DcERF-1的启动子。双荧光素酶瞬时表达试验证明DcERF-1能抑制乙烯生物合成途径中ACC氧化酶基因Dc ACO4的表达活性。综合结果表明Dc ERF-1负调控香石竹切花衰老。     

苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功能分析

苹果（Malus × domestica L.）和梨（Pyrus communis L.）果实在低温储存过程中虎皮病的发生与果皮中受乙烯诱导的α–法尼烯合酶基因（AFS）的表达及α–法尼烯的积累密切相关。采用TAIL-PCR技术分别从‘富士’苹果和‘丰产’梨中克隆到了约2 kb的α–法尼烯合酶基因（AFS）启动子序列,并提交至GenBank中（登录号分别为KM676083和KM676082）。序列比对发现两启动子同源性仅为48.31%,远低于其下游编码区97%的相似度。顺式作用元件在线预测分析发现二者同时存在乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素响应元件,低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件,以及3个节律性表达元件和2个诱导子响应元件。对‘丰产’梨中AFS基因表达模式的分析也证实了部分预测的诱导因素对其表达有调控作用。将‘丰产’梨AFS基因启动子序列进行系列删除,与GUS报告基因构建融合表达载体转化烟草,利用GUS染色方法分析了不同长度启动子的转录活性差异,发现缩短至153 bp的启动子片段仍具有较强的转录活性,且长度在276 bp至573 bp的启动子片段其驱动下游基因转录的活性较其他片段更强。通过后续对各作用元件尤其是乙烯响应元件的研究将有助于进一步从分子水平认识虎皮病的发生机制。     

苹果磷酸果糖激酶基因MdPFPβ调控果实可溶性糖积累的功能

为阐明苹果（Malus×domestica Borkh.）磷酸果糖激酶基因MdPFPβ(Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta,基因序列号MD09G1112800)的生物学功能,首先分析了基因启动子和全长序列信息,该基因包含全长为483 bp完整的开放阅读框,编码161个氨基酸。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件分析发现,MdPFPβ启动子序列中含有与脱落酸（abscisicacid,ABA）、低温及干旱信号相关的调控元件。荧光定量PCR分析发现,MdPFPβ在苹果叶片和成熟果实中表达量较高,并且受外源ABA的诱导表达。在外施ABA的条件下,MdPFPβ过量表达的苹果愈伤组织中可溶性糖含量明显上升。此外,MdPFPβ转基因番茄植株的光合性能增强,MdPFPβ可能通过调控糖代谢酶的活性最终影响果实中的可溶性糖含量。     

调控黄瓜苦味基因Bi的AP2/ERF家族转录因子

从华北型黄瓜‘9930’中克隆了黄瓜苦味形成的关键基因Bi的启动子序列,通过酵母单杂交技术对黄瓜叶片cDNA文库进行筛选,寻找可以调控Bi表达的转录因子。通过对筛选结果的测序及比对,发现有7种转录因子重复出现,包括2个AP2/ERF家族、3个bZIP家族、1个WRKY家族转录因子和1个E3泛素类COP1蛋白。其中AP2/ERF家族转录因子CsERF（登录号：Csa7M448110）重复出现6次,出现概率高于其他转录因子。利用烟草瞬时表达系统,CsERF对Bi启动子的结合及激活作用得到了进一步验证。初步证明CsERF可以结合到Bi的启动子并激活其转录,推测其很可能就是黄瓜叶片中调控苦味形成的关键转录因子。     

杭州地区不同需冷量甜樱桃品种休眠阶段花芽转录组分析

为探究中国南方暖湿地区甜樱桃适栽品种花芽休眠阶段的分子调控机制，以杭州地区种植的2个不同需冷量甜樱桃品种‘布鲁克斯’和‘萨米脱’为材料，分别于休眠前期（S1）、内休眠期（S2）和萌芽前期（S3）采集花芽，通过转录组测序比较2个品种间的基因表达差异。分析表明，S1、S2和S3时期分别获得343、671和1 588个差异表达基因，其中S3的差异基因数最多。GO分析表明，细胞组建、细胞代谢过程、刺激响应以及转运蛋白活性相关的基因在3个时期品种间均表现出显著差异。KEGG分析表明，S3富集的差异基因数及相关代谢途径最多，主要集中在糖代谢和蛋白质合成加工相关途径以及植物—病原互作、植物激素信号转导等途径，表达趋势分析显示部分差异基因可能参与调控甜樱桃花芽休眠状态的转换。通过转录因子预测分析，筛选到包含9个转录因子家族的42个差异表达转录因子，其中AP2/ERF、MYB、WRKY、C2H2、C3H和MADS-box家族的13个转录因子在S2的表达量显著高于S1和S3，表明这些转录因子可能参与了甜樱桃花芽休眠期的调控。     

SlGLK2转录因子在番茄品种Heirloom果实中的功能及变异分析

Goldern2-Like(SlGLK2)基因是调控未成熟果实叶绿体发育重要的转录因子。番茄(Solanum lycopersicum)未成熟果实中叶绿体对成熟果实的糖类、风味物质积累和提高番茄品质具有一定的作用。Heirloom品系作为优异的种质资源,在果实颜色、大小、形状和风味等方面有很大差异。以32个Heirloom品种为研究材料,通过表型调查研究果实表型性状,检测果实不同部位和不同发育时期叶绿素含量,筛选20个Heirloom品种克隆SlGLK2基因和启动子序列,运用荧光定量PCR分析调控果实叶绿体发育的相关基因,从而分析基因间的调控关系,以期研究SlGLK2转录因子对Heirloom品种叶绿体发育的影响。结果表明:含有SlGLK2基因的品种,未成熟果实拥有深绿色果肩,其不同发育时期绿色果实果肩的叶绿素含量明显高于果实底部。在SlGLK2基因上游非编码区和编码区共发现21个单核苷酸多态性(SNPs),经聚类分析发现,部分SNPs与未成熟果实的表型相关。果实叶绿体发育相关基因的表达分析表明TKN2、TKN4和在番茄果实的果肩部表达量明显高于果实底部,且TKN2、TKN4位于SlGLK2上游并调控SlGLK2基因的表达。     

番木瓜果实软化相关CpEXPA2基因的克隆与表达分析

【目的】克隆一个与番木瓜果实软化相关的扩展蛋白基因,分析其功能,明确其在不同组织器官和不同成熟时期果实的表达模式。【方法】基于对番木瓜果实转录组学的研究,筛选并克隆了一个与果实软化相关的扩展蛋白基因Cp EXPA2。采用同源序列对比和系统进化树分析对该基因进行序列分析;运用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行结构分析;使用RT-q PCR方法分析Cp EXPA2基因在不同组织器官、不同成熟时期果实中的表达量;采用GY-4硬度计测定不同成熟时期番木瓜果实的硬度。【结果】Cp EXPA2基因的开放阅读框(ORF)为780 bp(Gene Bank登录号为MF662209),编码259个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列具有典型的扩展蛋白保守结构:N端富含8个半胱氨酸、C端富含4个色氨酸和中间1个组氨酸功能域(His-Phe-Asp,HFD)。同源序列比对分析发现该扩展蛋白与山木瓜(ABF48653.1)、番茄(AAC64201.1)、草莓(AAF21101.1)、拟南芥(AAB38073.1)等扩展蛋白氨基酸序列有较高的同源性,分别为66.15%、64.86%、66.80%、65.00%。进化树分析表明,Cp EXPA2蛋白与拟南芥At EXPA6(U30480)、At EXPA16(NM_115407)关系最近。Cp EXPA2在不同组织器官中的表达量依次为成熟果实叶花茎根;在不同发育时期的果实中,Cp EXPA2在果皮的表达量相对高于果肉,且随着果实成熟软化程度提高,其表达量也相应提高。番木瓜果实的硬度随着果实的成熟呈逐渐下降趋势,在破色期开始硬度急剧下降,果实迅速软化。【结论】Cp EXPA2基因的扩展蛋白家族高度保守,且该基因编码的蛋白与山木瓜、番茄、草莓、拟南芥等扩展蛋白的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树分析发现番木瓜Cp EXPA2与拟南芥At EXPA6和At EXPA16亲缘关系较近。Cp EXPA2受乙烯诱导,且与果实发育进程有关,因此推测该基因可能在番木瓜果实成熟软化过程中发挥着重要的作用。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

杧果MiLCYB2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】了解杧果Mi LCYB2基因的表达调控规律。【方法】应用染色体步移方法克隆了991 bp的Mi LCYB2基因启动子序列。【结果】用在线软件Plant CARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有ABA、GA、Auxin、SA、Me JA多种植物激素响应元件,以及参与生理周期调控、MYBHv1结合位点和光响应元件等一些其他的调控序列,推测Mi LCYB2基因的表达受多种植物激素、光照、生理周期、MYBHv1转录因子等的调控。【结论】杧果Mi LCYB2基因启动子的分离与序列分析为进一步探究杧果类胡萝卜素基因的调控机制提供了新的理论基础。     

苹果乙烯响应因子MdERF1B-like的克隆与功能鉴定

以‘泰山早霞’苹果发育期中未着色和着色的果实为试材,利用q RT-PCR分析花青苷和乙烯通路相关基因的表达。分离出1个乙烯响应因子,暂命名为MdERF1B-like(MDP0000167207),其开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸。在‘泰山早霞’苹果着色与未着色果实中,MdERF1B-like表达量变化与花青苷合成基因MdDFR、MdANS和调控基因MdMYB9的表达趋势一致。系统进化树分析表明,MdERF1B-like位于第Ⅸ组,与PyERF1B-like亲缘关系最近。在‘王林’苹果愈伤组织中过表达MdERF1B-like,其花青苷含量显著高于对照。分析MdMYB9启动子序列,其长度为746 bp,序列中含有1个ERF潜在结合元件RAA(TGTTG),酵母单杂表明MdERF1B-like与MdMYB9启动子结合。进一步通过荧光素酶报告试验验证MdERF1B-like促进MdMYB9启动子的转录活性。因此,MdERF1B-like可能通过对MdMYB9的调控来促进苹果花青苷积累。     

菠萝AcSERK1 启动子的转录起始位点及胚性细#br# 胞特异性鉴定

 AcSERK1 是菠萝（Ananas comosus）体细胞胚发生初期特异表达的基因,为探讨其转录调控 规律,对其5′上游调控序列的转录起始位点及启动特性进行了鉴定。采用hiTAIL-PCR 技术从菠萝基因组 DNA 中克隆了AcSERK1 完整的5′上游调控序列,利用5′RACE 技术鉴定出其转录起始位点位于起始密码 子（ATG）上游258 nt（G）处。以AcSERK1 5′上游完整调控序列取代pBI121 中的CaMV 35S 启动子,构 建植物表达载体AcSERK1（–2 090/+258）︰︰GUS,并在菠萝不同组织器官中进行瞬时转化分析,发现AcSERK1 5′上游完整的调控序列（–2 090/+258）能够启动GUS 在胚性细胞中特异性表达,与AcSERK1 表达规律相 同,说明该启动子为胚性细胞特异性启动子,对调控外源基因在体细胞胚早期特异表达有重要意义。     

PG酶与果实的成熟软化

多聚半乳糖醛酸酶（PGs）是一种在细胞壁结构的改变中起重要作用的酶，它可以催化果胶分子中α～（1、4）－聚半乳糖醛酸的裂解，从而参与果胶的降解，它与果实的软化密切相关。PGs具有2或3种同工酶，它们分别出现于果实发育的不同阶段。PGs是由多基因家族编码的，各基因家族成员分别调节不同时空的表达，通过反义RNA技术和插入失活的方法可对PG基因进行调控。乙烯在翻译水平控制PG基因的表达而对PGmRNA的转录没有影响。气调贮藏、热处理、钙处理等贮藏措施能抑制果实PG酶的活性，延缓果实的后熟软化进程。综述了多聚半乳糖醛酸酶（PG酶）在果实成熟中的作用、PG酶同工酶、PG酶基因及其表达调控、乙烯及贮藏措施对PG酶活性和果实软化的调控。     

NAC转录因子在果实成熟中的调控作用

NAC转录因子是植物中最大的特异性转录因子家族之一，其依赖由高度保守的N端结构域和高度变异的C端转录调控结构域组成独特的NAC结构域发挥功能，在果实成熟的调控中发挥着重要的作用。在介绍NAC转录因子的结构特征及不同物种NAC基因的成员与分类的基础上，总结了近年来NAC转录因子在果实成熟过程中的积极作用，包括促进果实软化影响果实质地，促进叶绿素降解及类胡萝卜素、类黄酮和花色苷的合成决定果实着色、调控糖分积累影响果实糖酸比例以及促进多种芳香化合物合成积累形成果实特有风味、果实脱涩等方面，并阐述了NAC转录因子与内源激素特别是乙烯和ABA交互在调控果实成熟中的重要作用。总结了NAC转录因子调控果实成熟的潜在机制以及影响NAC表达的因素与分子通路，旨在为在果实成熟性状遗传改良与调控技术研发提供重要参考。     

柑橘转录因子CsbHLH3调控柠檬酸代谢的功能解析

转录因子CsbHLH3调控柑橘果实柠檬酸代谢过程中的具体机制尚不清楚。以冰糖橙果实cDNA为材料，克隆了CsbHLH3。瞬时转化烟草亚细胞定位显示CsbHLH3蛋白定位在细胞核。异位表达CsbHLH3的阳性番茄果实中CsbHLH3的表达显著上升，同时柠檬酸含量显著降低。定量分析表明，CsbHLH3在番茄中异位表达引起了柠檬酸降解相关基因SlACO3b、SlGDH及液泡膜质子泵基因SlPH8的上调。相反，在冰糖橙叶片中瞬时抑制CsbHLH3会引起柠檬酸降解相关基因CsGABP、CsACO2、CsACLα1、Cs ACLα2及液泡膜质子泵基因CsPH8、CsVHP2、CsVHP3的下调表达，其柠檬酸含量显著高于空载对照。通过酵母单杂交和EMSA试验证实CsbHLH3均能够靶定PH8和GABP启动子调控其表达。上述结果表明转录因子CsbHLH3是通过调控柠檬酸代谢途径多个相关基因包括PH8和降解途径基因GABP的表达综合负调控柠檬酸的水平。