柑橘转录因子基因CitMYB22的分离、表达及亚细胞定位分析

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为材料,利用RT-PCR技术,分离到1个MYB基因,CitMYB22。比对分析发现,CitMYB22含有两个内含子,开放阅读框(ORF)为696 bp,可编码231个氨基酸残基的多肽。氨基酸聚类和结构分析表明,CitMYB22属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族。进化树分析表明,CitMYB22与拟南芥参与逆境响应的R2R3-MYB亚家族成员At MYB15的同源性最高。克隆CitMYB22的ATG上游2 500 bp内启动子顺式元件,预测其含有多个与植物逆境和激素应答相关的顺式作用元件,如HSE、SARE和MBS等。亚细胞定位结果显示CitMYB22蛋白定位在细胞核中。实时定量结果表明,CitMYB22在叶、花中的表达量明显高于根和幼果,且在外源脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸、1–氨基环丙烷基羧酸以及高盐、脱水和4℃低温等非生物逆境胁迫下,均被诱导上调表达,推测CitMYB22可能与‘资阳’香橙的抗逆性相关。     

越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析

以‘泽西’越橘（Vaccinium corymbosum‘Jersey’）不同发育阶段的果实为试材,构建De novo转录组测序文库并进行数据分析,利用WebLogo 3、CLC Sequence Viewer 6等软件和荧光定量PCR技术对所获数据中的R2R3-MYB转录因子进行生物信息学分析和表达分析。结果表明,转录组测序共获得有效数据6.01 Gb,通过组装得到Unigene序列60 481个。功能注释结果显示,有39 612个Unigene可以注释到GO和COG等数据库上;20 869个Unigene无匹配信息。利用GO和COG分类工具可将这些序列分别划分为55个和25个功能类别,涉及信号转导和转录调控等功能。利用所获数据分析越橘R2R3-MYB基因,结果表明共得到21个R2R3-MYB。序列分析显示,这21个基因均含有完整的R2R3-MYB区域,在此区域内2（G）和4（W）等30个氨基酸保守不变。进化树分析结果显示,越橘R2R3-MYB基因分为11个亚组。其中,S4、S5和S6亚组中有6个基因涉及到花青苷生物合成。荧光定量PCR结果分析显示,这6个基因在果实发育的7个阶段均能表达,但表达模式不同,这6个基因可能对越橘果实着色具有一定作用。     

百香果（Passiflora edulis）R2R3-MYB基因家族的结构和功能分析

【目的】探究R2R3-MYB转录因子在代谢、发育等多种生物学过程中发挥的调控作用。对百香果R2R3-MYB基因家族进行表达分析并探究其在花果发育过程中的调控机制,对深入研究R2R3-MYB转录因子在百香果中的生物学作用中具有重要意义。【方法】基于百香果全基因组数据,通过HMM搜索对R2R3-MYB家族成员进行筛选鉴定,并利用实时荧光定量PCR分析其在百香果花不同组织中的表达模式。【结果】从百香果基因组中鉴定出99个R2R3-MYB基因,根据系统进化分析将其分为36个亚组。99个R2R3-PeMYB基因随机分布在9条百香果染色体上。基序和基因结构分析表明,R2R3-PeMYB在同一亚组中具有相对保守的结构特征。共线性分析表明,片段复制事件促进了百香果R2R3-MYB家族的扩张。基于转录组数据和qRT-PCR分析,发现R2R3-PeMYB基因在百香果花的不同组织的不同发育阶段中表现出差异的表达模式,说明R2R3-PeMYB基因在花不同组织和果实的发育过程中发挥重要作用,尤其是PeMYB62和PeMYB63在百香果果皮转色期的高表达,说明其可能参与百香果花青素的合成。同时8个R2R3-PeM...     

中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究

为研究中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中类黄酮代谢途径的调控网络,从其转录组中筛选出1条R2R3-MYB基因并从花瓣cDNA中克隆其编码区全长序列,命名为NtMYB5。NtMYB5开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸。蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域以及1个pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序;系统进化树分析表明,NtMYB5与花青素合成抑制因子亲缘关系最近;通过对NtMYB5在中国水仙中的表达检测发现,其表达量在花器官中较高,且随花开放逐渐上升;在烟草瞬时表达中,NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果;转NtMYB5烟草花瓣颜色变浅,qPCR检测表明NtMYB5抑制类黄酮代谢途径大部分结构基因表达。NtMYB5为中国水仙中花青素合成抑制因子。     

柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响

查尔酮的合成是类黄酮生物合成途径中的一个关键节点。从10个柑橘种质中克隆了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,并对其不同时期的果实和叶片中的类黄酮含量进行了测定,分析了CHS基因的序列多态性与类黄酮含量之间的关系;同时通过qRT-PCR检测了CHS基因在不同种质之间以及同一种质的不同组织间的表达差异。结果表明,柑橘CHS基因的核苷酸序列高度保守,相似度达98%以上。聚类分析表明,CHS氨基酸序列的多态性有物种特异性,而且与类黄酮含量有一定的相关性。CHS基因的表达水平在不同种质、部位及生长发育时期有显著差异,这些差异与类黄酮的含量有显著的相关性,说明CHS基因对类黄酮的生物合成有明显影响。     

石榴花青苷合成相关基因PgMYB111的克隆与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子调控石榴花青苷合成的机理,以石榴品系‘榴花红’（红花）和‘榴花白’（白花）为试材,利用同源克隆技术分离出1个调控花青苷生物合成的R2R3-MYB基因PgMYB111(Pg012177.1)。其CDS全长为1 101 bp,编码366个氨基酸。多重比对分析表明,PgMYB111蛋白的N端含有1个R2R3保守结构域,以及1个与bHLH蛋白互作的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结合位点。系统发育树分析表明,PgMYB111与苹果和扁桃具有较高的同源性,聚为一簇。亚细胞定位试验发现,PgMYB111定位于细胞核。PgMYB111在‘榴花红’中的表达量是‘榴花白’的4.3倍,且‘榴花红’花瓣花青苷含量也显著高于‘榴花白’。烟草瞬时表达结果表明转基因烟草叶片的花青苷含量和基因表达量呈先上升后下降的趋势,均在第5天达到最高,分别是未侵染叶片的3.8倍和8.9倍,pBI121空载叶片的3.17倍和5.57倍。结果表明PgMYB111参与了花青苷合成途径并促进其合成。     

重庆开县3个锦橙品种留树贮藏试验初报

对重庆市开县3个锦橙品种留树贮藏效果进行探索,结果表明,‘开陈72-1’、‘开盛76-8’和‘北碚447’3个锦橙品种留树贮藏至2月下旬,能维持较高的坐果率、商品果率、外观色泽和可溶性固形物含量;‘开陈72-1’最适宜做开县锦橙留树贮藏品种。     

CsAREB转录因子在柑橘果实发育中的作用

以江津甜橙的低酸小果变异品种‘长叶橙’(Citrus sinensis L.Osbeck‘Changyecheng’)和高酸大果芽变品种‘大果锦橙’(C.sinensis L.Osbeck‘Daguo Jincheng’)为材料,对其AREB(ABA responsive element binding)/ABFs(ABRE binding factors)转录因子基因,即CsAREB1和CsAREB2进行了生物信息学及时空表达分析;采用酶联免疫法(ELISA)测定了不同发育时期果实内源激素(ABA、IAA、GA和ZR)含量。结果表明:CsAREB1的开放阅读框(ORF)长度为1 338 bp,编码445个氨基酸;CsAREB2的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸。CsAREB1和CsAREB2在叶、花、果中的表达存在组织特异性。在果实发育过程中,CsAREB1的表达量在‘长叶橙’中呈上升趋势,在‘大果锦橙’中呈先降后升趋势;CsAREB2的表达量在2个品种中总体均呈上升趋势。在果实细胞分裂期,‘长叶橙’果实CsAREB1、CsAREB2的表达量高于‘大果锦橙’,而在果实膨大期的果皮组织中‘长叶橙’低于‘大果锦橙’,在果肉组织中没有显著差异。两品种CsAREB1和CsAREB2的表达均受外源ABA的诱导。在细胞分裂期和膨大期的果皮组织中‘大果锦橙’中IAA、GA、ZR含量,以及IAA、GA、ZR与ABA的比值均高于‘长叶橙’,而在膨大期果肉组织中这一比值低于‘长叶橙’。随着果实的发育,CsAREB1和CsAREB2的表达量变化与果实内源ABA的含量变化趋势基本一致,而与其他内源激素的含量变化无明显相关关系。研究结果表明:CsAREB1和CsAREB2的转录水平受ABA的调控,通过参与柑橘果实ABA生成,影响柑橘果实体积发育过程。     

柑橘SQS基因的克隆及功能分析

从18个柑橘品种中克隆角鲨烯合成酶(squalene synthase,SQS)基因,分析其序列和表达特性,通过遗传转化研究该基因在柑橘类柠檬苦素生物合成过程的作用。结果表明,除了‘融安金柑’和‘小果罗浮’外,SQS基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 242 bp,编码413个氨基酸。序列比对发现,18个品种的氨基酸序列保守性为97.1%～100%,‘小果罗浮’‘融安金柑’和‘4号宜昌橙’等品种在CDS区第14位碱基发生G/C非同义突变。系统进化树显示,‘小果罗浮’‘融安金柑’和‘4号宜昌橙’的SQS具有较近的遗传距离。qRT-PCR结果表明,柑橘SQS基因在花中的表达水平最高,成熟茎中其次,幼嫩茎、根和叶片中再次,幼果中最低。‘琯溪蜜柚’不同发育时期种子中SQS基因表达水平与类柠檬苦素含量呈极显著正相关。4株SQS基因干扰的‘锦橙’株系(SiN-1～SiN-4)叶片中的SQS基因表达水平为对照的61.00%～79.00%;柠檬苦素含量为对照的35.83%～81.56%;SiN-1和SiN-2叶片中的诺米林含量分别为对照的80.11%和94.94%,而SiN-3和SiN-4中的诺米林含量分别比对照提高52.76%和35.30%。SQS基因干扰植株中控制三萜类和甾醇类生物合成的氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)基因出现差异性调控,大多数OSC基因的表达水平降低。以上结果表明,SQS是控制类柠檬苦素、三萜类和植物甾醇类物质生物合成的关键基因,能显著影响类柠檬苦素化合物的生物合成。     

若干锦橙品种果皮酚类物质及其抗氧化与抑菌作用

【目的】测定若干锦橙品种果皮的酚类物质成分及含量,比较分析各锦橙品种果皮酚类物质抗氧化活性,评价各锦橙品种果皮中酚类物质抑菌效果。【方法】用甲醇超声提取各锦橙品种果皮中的酚类物质,紫外分光光度法测定总酚和总黄酮含量;采用高效液相色谱法(HPLC)分析检测类黄酮和酚酸成分,并与标准品色谱图结合进行定性和定量;通过DPPH、FRAP、ABTS 3种方法比较分析各锦橙品种果皮酚类物质抗氧化活性;用菌丝生长速率法测定各锦橙品种果皮酚类物质对霉菌的抑制率。【结果】锦橙品种果皮中总黄酮含量均高于总酚含量,总黄酮含量最高的品种是‘蓬安100号’锦橙(PA),总酚含量最高的品种是‘涪陵锦橙’(FL)。各锦橙品种锦橙皮中检测到的酚类物质成分共有14种,其中10种类黄酮中主要成分是橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素和香叶木素,橙皮苷和芸香柚皮苷含量最高的品种是‘蓬安100号’锦橙(PA),川陈皮素含量最高的品种是‘北碚447’锦橙(BB),香叶木素含量最高的品种是‘铜水72-1’锦橙(TS)。4种酚酸中没食子酸含量最高,且没食子酸含量最高的品种是‘涪陵锦橙’(FL)。用DPPH、FRAP、ABTS 3种方法测得各锦橙果皮酚类物质均具有抗氧化活性,综合抗氧化能力最强的品种是‘蓬安100号’(PA)。各锦橙品种果皮酚类物质提取物对霉菌具有较强的抑制效果,且绿霉对不同浓度的提取物敏感性强于青霉。【结论】各锦橙品种中‘蓬安100号’(PA)锦橙果皮的抗氧化活性和抑霉菌效果最强,可为抗氧化和抑菌剂的研发提供资源。     

桂花R2R3-MYB家族基因鉴定及其在花开放过程中的表达分析

对桂花（Osmanthus fragrans）R2R3-MYB转录因子进行鉴定和生物信息分析，分析相关基因在花开放过程中的表达，获得了响应相对低温调控桂花花开放和着色等的关键基因。利用转录组数据分析得到35个桂花R2R3-MYB，这些基因均包含R2R3结构域，且高度保守。通过分析MYB基因在19 ℃（花能开放）和23 ℃（花不能开放）处理以及不同组织中的相对表达量发现，OfMYB1、OfMYB12、OfMYB14、OfMYB23、OfMYB24随着花的开放表达量逐渐升高，其中OfMYB1和OfMYB14在盛花期的花瓣中表达量最高，表明其可能参与桂花着色的过程；而OfMYB4、OfMYB5、OfMYB17、OfMYB28、OfMYB34在花开放过程中的表达量呈先升高后降低的趋势，尤其是OfMYB5、OfMYB17在花芽（圆珠期）中表达量最高，表明其可能参与了花开放过程的调控。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

‘秋姬李’PsMYB18基因克隆与功能分析

【目的】克隆在采后‘秋姬李’果皮积累花色苷过程中高表达的MYB抑制因子PsMYB18基因,研究其序列特征、表达特点与功能。【方法】以‘秋姬李’为试材,采用qRT-PCR分析不同温度和光照处理条件下‘秋姬李’果皮中PsMYB18基因的转录水平,采用RT-PCR克隆PsMYB18基因,并通过烟草叶片瞬时表达试验分析PsMYB18的功能。【结果】q RT-PCR分析表明20℃和光照处理可促进‘秋姬李’果皮PsMYB18基因表达。PsMYB18基因的开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸的蛋白。进化树分析表明PsMYB18与其他植物的花色苷合成抑制因子亲缘关系较近。序列比对结果表明其具有保守的R2R3结构域和抑制基序C1和C2。烟草瞬时表达试验表明,PsMYB18可抑制正调控因子PsMYB10.1和PsbHLH3的花色苷合成诱导功能。【结论】‘秋姬李’PsMYB18为花色苷合成抑制因子。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

嫁接对柑橘microRNA表达的影响

以‘锦橙’、‘资阳香橙’、‘飞龙枳’实生苗和‘锦橙’/‘资阳香橙’、‘锦橙’/‘飞龙枳’嫁接苗为试材,通过荧光定量PCR检测miRNA及其靶基因在嫁接苗和实生苗叶片和根系中的表达差异,分析嫁接对柑橘microRNAs及其靶基因表达的影响。结果证明嫁接对柑橘miRNA的表达有直接的影响。嫁接的影响更多地是促进接穗中一些与调控植物生长发育、胁迫应答及激素信号转导相关的miRNA的表达,并抑制了其对应靶基因的表达;而在砧木中,嫁接对根系的影响较多表现为抑制与植物生长发育、胁迫应答相关的miRNA的表达,促进其靶基因的表达。受影响的miRNA的种类及其表达的差异水平在不同砧木间有明显差异。     

葡萄中盐诱导的R2R3-MYB 基因的筛选与表达分析

 以葡萄砧木‘1103P’为试材,筛选获得了4 个受盐强烈诱导的R2R3-MYB 基因,系统进化 分析表明其编码蛋白属于不同的拟南芥R2R3-MYB 亚组。该4 个基因在根、茎、叶和果实中呈组成型表 达,但具有不同的表达水平,尤其是VvMYB112 在葡萄根系中具有较高的表达水平。在4 个基因中, VvMYB112 能响应100 ~ 200 mmol · L-1 高盐处理。此外,VvMYB112 和VvMYB15 也能被聚乙二醇（PEG6000） 和低温诱导,而VvMYB107 和VvMYB87 对PEG6000 和低温不敏感或受其抑制。表明这4 个基因可能通 过不同的途径介导抗盐性。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

红花草莓‘莓红’花瓣花色苷积累及其MYB基因的表达分析

以红花草莓品种‘莓红’为研究材料,观察花瓣发育过程中色泽及花色苷变化规律,同时对4个发育时期花瓣进行转录组测序,基于相关性筛选花色苷合成途径的关键功能基因及转录调控因子,结果表明:(1)花瓣发育过程中,花色苷总含量呈先升后降趋势,且在半开期达到最高;(2)花色苷合成途径关键功能基因FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaDFR、Fa3GT表达水平与花色苷含量正相关;(3)R2R3-MYB基因FaMYB6和FaMYB90与花色苷含量呈正相关;(4)Pearson相关性分析表明FaMYB6与FaPAL、FaDFR显著正相关,FaMYB90与FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaDFR、Fa3GT极显著正相关,Fa MYB82则与上述5个结构基因之间均极显著负相关。综上,‘莓红’草莓花瓣发育过程中,花色苷积累引起花瓣颜色变红,FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通过调节FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表达来调控花瓣色泽形成。     

百子莲MYB家族鉴定及蓝色形成关键基因功能分析

利用生物信息鉴定百子莲MYB家族成员，挖掘并验证了调控百子莲蓝色花色形成的关键基因。以全长转录组测序数据作为参考序列，鉴定得到百子莲123个MYB家族成员，包括60个R2R3-MYB、4个3R-MYB、2个4R-MYB和57个1R-MYB基因。对调控类黄酮生物合成的主要亚家族R2R3-MYB进行分析发现，R2-和R3-repeats的序列较为保守，根据系统进化关系分为22个亚组（A1～A22）。特殊的是，相较拟南芥的25个亚组，百子莲缺乏正向调控花色素苷合成的典型亚组S6。与花色形成相关的其他亚组有A18、A17和A16，其成员ApMYB4、ApMYB6、ApMYB7、ApMYB12和ApMYB111定位于细胞核，ApMYB123集中分布于核仁中。在蓝色百子莲花瓣着色过程中，ApMYB12显著上调表达，而ApMYB111显著下调表达。ApMYB4、ApMYB6和ApMYB7在蓝花各发育阶段的表达量均低于白花，预示这些基因可能是百子莲蓝色形成的负调控因子。ApMYB123在白花的开放前期大量表达，说明该基因可能在此阶段促进花瓣合成原花青素。在烟草中过表达ApMYB12，烟草花瓣颜色较野生...