苹果MdMYB116对白粉病的抗性研究

以抗白粉病的‘嘎拉’苹果为试材,克隆得到MdMYB116的cDNA全长序列。该基因的开放阅读框为900 bp,编码299个氨基酸,含有2个保守结构域。系统进化树结果表明,MdMYB116与梨PbMYB108-like的相似性最高,为93.38%。亚细胞定位试验显示MdMYB116定位在细胞核内。MdMYB116接种苹果白粉病菌6～12 h表达量上升,并达到高峰。酵母转录激活验证得出MdMYB116全长含有自激活活性。将MdMYB116异源转化拟南芥,得到的转基因植株接种白粉病菌处理后,其抗性显著高于野生型和pad4突变体植株。组织化学染色观察发现,与野生型和pad4突变体植株相比,转基因株系活性氧积累水平更高,死细胞数量和胼胝质积累也更多,说明转基因株系存在较严重的过敏致死情况,证明MdMYB116参与植株对白粉病的免疫调节反应。通过分析相关抗病基因的表达结果,说明MdMYB116通过参与SA和/或MeJA的信号途径增强防御反应。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

基于辐热积的日光温室嫁接茄子养分积累模型

以茄杂2号为试材，采用嫁接栽培，分析5个施氮水平下茄子全株及茎、叶片、果实养分积累量的动态变化，建立了基于辐热积的日光温室嫁接茄子养分积累模拟模型，并对模型进行了验证。结果表明，该模型可以利用辐热积比较准确地模拟出不同施氮水平茄子养分积累量，以产量最高的F3处理作为参照，其植株N、P、K积累量的标准误差RMSE和1∶1直线决定系数R2分别为4.88 kg·hm^-2和0.996 8、0.53 kg·hm^-2和0.998 3、7.85 kg·hm^-2和0.997 1；茎中N、P、K积累量的标准误差RMSE和1∶1直线决定系数R2分别为1.66 kg·hm^-2和0.957 6、0.59 kg·hm^-2和0.956 1、3.89 kg·hm^-2和0.982 0；叶片中N、P、K积累量的标准误差RMSE和1∶1直线决定系数R2分别为2.19 kg·hm^-2和0.976 8、0.40 kg·hm^-2和0.985 3、4.06...     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

钾对刺葡萄果实品质及糖分代谢相关酶活性的影响

以5年生刺葡萄为材料，采用基质栽培，研究了不同施钾水平对刺葡萄果实可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物含量及糖代谢相关酶活性的影响。结果表明：与不施钾肥相比，增施钾肥能显著提高刺葡萄果实中可溶性固形物及各糖组分含量，降低果实中酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量。其中，施钾量540 g/株处理的可溶性糖含量最高，说明适量施钾有利于促进刺葡萄果实中糖分的积累。同时，施钾显著提高了刺葡萄果实发育早期酸性转化酶和蔗糖合成酶的活性，对中性转化酶、蔗糖磷酸合成酶影响较小，施钾量540 g/株处理各时期代谢酶的活性最强，说明适量施钾提高了刺葡萄果实发育过程中各有关代谢酶活性，促进了果实中果糖和葡萄糖的积累。     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

山地长季节设施辣椒需肥规律研究及水肥耦合对养分吸收的影响

以“杭椒12”为试材，采用追施水溶肥与传统栽培为对照，研究了辣椒种植土壤pH和养分物质含量变化规律、辣椒生长期需肥规律、土壤和植株养分吸收、水肥耦合追施高钾水溶肥对辣椒植株养分吸收的影响，以期改变山地长季节设施栽培杭椒类辣椒的传统生产方式，实现水肥耦合技术。结果表明：随辣椒生长周期变长，种植土壤速效钾含量下降226.00 mg·kg^-1(P<0.05),有效磷含量先增加11.95 mg·kg^-1后下降15.18 mg·kg^-1(P<0.05)。盛收期辣椒N和P含量果实>叶>茎>根，K含量叶>果实>茎>根，Ca含量叶>根>果实>茎。从辣椒生长初期到末期，种植土壤营养物质含量减少K>Ca>N>P,植株营养物质含量增加K>N>P>Ca。利用水肥耦合技术追施高钾水溶肥，使盛收期辣椒叶和根K含量增加3.95 g·kg^-1和2.69 g·kg^-1(P<0.05)。传统山地长季节栽培模...     

甜橙CsKT1的钾转运功能鉴定及其互作蛋白分析

植物K~+的跨膜运输过程是由细胞膜上的钾转运蛋白介导的。分析甜橙基因组序列信息发现,甜橙CsKT1与拟南芥Shaker家族成员中的AKT1同源性最高,具有典型的Shaker钾通道特征。互补钾吸收缺陷酵母的试验结果显示,表达CsKT1的钾吸收缺陷酵母能在K~+浓度为10、1和0.1 mmol·L~(-1)的培养条件下生长。以‘冰糖橙’(Citrus sinensis L. Osbeck‘Bingtangcheng’)为试验材料,利用qRT-PCR方法检测到CsKT1在植株根部的表达量比冠部高,并且低钾(0.1mmol·L~(-1)K~+)胁迫处理24h时植株中CsKT1的转录水平无明显变化。亚细胞定位检测结果显示,CsKT1能定位到细胞质膜上。利用酵母双杂交试验发现,CsKT1蛋白C端能与拟南芥CIPK23互作,还能与甜橙CsCIPK7蛋白(与拟南芥CIPK23同源性最高)互作,同时甜橙CsCIPK7蛋白能与拟南芥CBL1蛋白互作;进一步的蛋白序列相似性分析结果显示,柑橘CBL家族有8个成员,其中CsCBL1与拟南芥CBL1、CBL9的同源性最高。这些结果说明,CsKT1是柑橘中的类AKT1钾转运蛋白。     

绢毛委陵菜PsWRKY40的克隆与耐镉功能分析

以绢毛委陵菜(Potentilla sericea)为材料，克隆得到PsWRKY40的c DNA全长序列。该基因的开放阅读框长978bp，编码325个氨基酸，属于WRKY家族GroupⅡ亚族。荧光定量PCR分析表明，PsWRKY40被NaCl、CdCl₂和甘露醇显著诱导表达。将PsWRKY40异源转化拟南芥，转基因植株在镉处理后，其对Cd的抗性显著高于野生型植株，AtSOD、AtPOD和AtCAT的表达量显著提高。上述结果表明PsWRKY40可被镉诱导，可能参与绢毛委陵菜抗镉调控。     

缺钾胁迫对连作草莓生长和土传病害的影响

 以草莓‘红颜’品种为试材,设缺K（K+ 48.75 mg · L^-1,缺量水平）、1/2K（K+ 415.58 mg · L^-1, 半量水平）和全量K（K+ 782.41 mg · L^-1,正常水平）营养液处理,对缺钾胁迫与草莓连作障碍的关系进 行了探讨。结果表明,缺钾处理显著抑制二茬草莓植株地下部分和地上部分的生长,其中缺K 的长势最 弱,1/2K 比全量K 的长势强;缺K 二茬植株根系分泌物对草莓组培苗生长有显著影响,表现为低浓度（1%、 2%）根系分泌物促进幼苗侧根和茎叶生长,高浓度（4%）则抑制根系生长。不同浓度钾营养液处理的三 茬植株分别接种尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌后,在不同时期比未经过连作的基质对照发病都严重。缺K 三 茬植株发病最重,接菌后10 d 时病情指数就高达75,全量K 三茬植株发病次之,1/2K 三茬植株发病相 对较轻。因此,缺K 环境会加重草莓的连作障碍,适宜的K 量对草莓连作障碍的防治有重要意义。     

桃PpSnRK1βλ1基因的克隆及在拟南芥中异源转基因的功能分析

以实生毛桃为试材,采用PCR和实时荧光定量技术,克隆桃树SnRK1蛋白激酶(蔗糖非发酵-1-型相关蛋白激酶-1)的调节亚基βλ,并分析其组织表达特性。构建p35S::PpSnRK1βγ1重组载体,获得超表达PpSnRK1βλ1基因拟南芥植株用于分析其生物功能。结果表明:克隆获得桃树SnRK1βλ1,命名为PpSnRK1βλ1。该cDNA全长为1 476bp,编码492个氨基酸。序列分析表明,其包含CBM和4个CBS结构域;PpSnRK1βλ1与果梅的SnRK1βλ蛋白亲缘关系最近;PpSnRK1βλ1基因在实生毛桃的根、茎、叶均有表达,其中在茎中表达量最低。超表达PpSnRK1βγ1基因拟南芥株系A-βγ1的花期比野生型晚2.19d,单株莲座叶数量比野生型多1.17片;叶片的叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白质含量均显著高于野生型拟南芥,分别比野生型提高了13.7%、12.9%和23.3%,但淀粉含量却没有显著性差异。在氧化胁迫条件下,转基因植株与野生型的生长均受到抑制,但前者具有更好的萌发率和主根长度,以保证植株正常生长。因此,PpSnRK1βλ1基因参与调控植株的碳氮代谢,并影响植物的花期,以及在防御氧化胁迫过程中起重要作用。     

转拟南芥AtNHX5基因烟草的耐盐性研究

采用农杆菌介导的叶盘法将来源于拟南芥的Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX5导入烟草,经潮霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,证明AtNHX5已导入烟草基因组并在转基因植株中表达。将转基因植株和非转基因(野生型)植株培养在含有300 mM NaCl的1/2MS培养基上,发现转基因植株的生长明显优于野生型。将在含有300 mM NaCl的1/2MS培养基中生长4周后的幼苗转移到不含NaCl的1/2MS培养基后,转基因植株快速恢复生长,而野生型植株则生长停滞。结果表明:超表达AtNHX5基因可以提高烟草的耐盐性。     

中国野生葡萄醛脱氢酶基因在拟南芥中的过量表达

将质粒pWR306中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1300,构建了植物中间表达载体pWR-II;将重组质粒pGEM-T-ALDH的醛脱氢酶(ALDH)基因片段定向克隆到pWR-II,构建了葡萄ALDH基因的植物过量表达载体pWR-II-ALDH。采用改进冻融法将其导入农杆菌EHA105,采用花序浸蘸法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性的转化拟南芥植株。PCR检测证明外源基因已整合进拟南芥基因组,Real-timePCR结果表明ALDH基因在转化植株的表达量远高于野生种。转化植株和野生植株在形态上有一定的差异,说明葡萄ALDH基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。     

苹果类受体激酶基因MdLYK1正调控对腐烂病的抗性

以苹果类受体激酶基因MdLYK1(MD09G1111800)为研究对象，结合生物信息分析、功能验证和表达分析，探究其对抗腐烂病的作用和可能的作用机制。结果表明，MdLYK1与拟南芥类受体激酶基因AtLYK1同源，氨基酸序列的相似性为68.1%。将该基因在‘烟富6号’苹果果实中瞬时过表达后显著提高了果实对腐烂病的抗性。将其导入杜梨悬浮细胞，获得3个过表达细胞系。接种腐烂病菌（Valsa pyri）后，菌落在所有过表达细胞系上的生长速度显著低于野生型细胞。与野生型相比，所有过表达细胞系对Valsapyri代谢物的敏感性显著降低。此外，MdLYK1过表达显著增强了杜梨悬浮细胞病原体相关分子模式触发的免疫反应、活性氧和茉莉酸等信号相关关键基因的上调表达。综上所述，MdLYK1正调控苹果和梨对腐烂病的抗性，且病原体相关分子模式触发的免疫反应、活性氧和茉莉酸等信号参与了其对抗性的调控过程。     

西洋梨PcHB12基因抑制果实花青苷的合成

为了解HD-ZipⅠ转录因子调控梨花青苷合成的机制,以西洋梨品种‘红茄梨’为试材,克隆了1个HD-ZipⅠ家族基因PcHB12(GenBank序列号XM₀09363028)。通过系统进化树分析、qRT-PCR、酵母单杂交、电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和荧光素酶报告试验,探究PcHB12调控梨花青苷合成的作用。结果表明,PcHB12的开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,预测的蛋白质分子量是26.77 kD。系统进化树分析表明,PcHB12与拟南芥AtHB12蛋白序列相似度最高。‘茄梨’中PcHB12的表达量明显高于其红色芽变品种‘红茄梨’,而花青苷含量和花青苷相关基因PcMYB10.1、PcUFGT的表达量明显低于‘红茄梨’。酵母单杂交和EMSA试验发现,PcHB12结合在PcMYB10.1启动子的MBS序列。荧光素酶试验表明PcHB12负调控PcMYB10.1启动子的转录活性。因此,PcHB12可能通过负调控PcMYB10.1的表达从而抑制梨花青苷的合成。     

砂梨(Pyrus pyrifolia)过敏原蛋白基因(Ppmal)的克隆与表达分析

【目的】分离和克隆梨过敏原蛋白基因Ppmal(Gen Bank登录号为KP008110),探讨其在梨果实发育过程中的功能。【方法】以砂梨品种‘翠冠’[Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai]为试材,在盛花期后30 d对植株果柄进行涂抹赤霉素处理,利用同源克隆和RACE方法克隆目的基因全长序列,并通过实时荧光定量技术和半定量技术分析该基因在梨不同组织以及梨果实发育过程中的表达变化。【结果】Ppmal的全长是906 bp,含有480 bp的开放阅读框(ORF),编码159个氨基酸,预测的蛋白质相对分子质量为17.56 k D,等电点为5.62。生物信息学分析显示该基因没有信号肽序列,没有跨膜结构域,具亲水性。与其他物种的过敏原蛋白基因核苷酸序列同源性超过75%,与苹果和西洋梨编码的氨基酸序列同源性分别高达97.48%和96.23%,进化树分析表明该基因与苹果的进化关系最近。同时,定量结果显示经过赤霉素处理后的果实中该基因的表达量随着果实的生长发育呈现先降低后升高的趋势,并且具有组织差异表达的特点,其表达量在叶片中最大,其次是嫩叶,再次是花,枝条最低。【结论】获得梨Ppmal基因全长,对该基因在砂梨品种‘翠冠’发育过程中的表达分析显示,Ppmal受到赤霉素的调控,并在砂梨果实膨大期发生上调表达。     

梨果实发育中Ca2+在果肉细胞的定位及变化研究*

 用焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法, 研究了􀀂 幸水 梨果实发育中果肉细胞的焦锑酸Ca²⁺ 定位变化及其与细胞超微结构的关系。结果表明: ( 1) 在未受精之前, 果肉细胞内未检测到Ca²⁺ 沉淀颗粒, 细胞核内的染色质少且染色淡, 细胞质的细胞器数量也少; ( 2) 受精后果肉细胞呈现大量的Ca²⁺沉淀颗粒, 主要分布在细胞核、细胞质、质体以及叶绿体外膜上, 含Ca²⁺沉淀颗粒的质体非常膨大, 导管和初期发育的石细胞内也密集分布Ca2+ 沉淀颗粒; ( 3) 受精1 周后果肉细胞的Ca²⁺移向细胞之间的连接处; ( 4) 生理落果的细胞和导管中Ca²⁺没有或极少, 但有的细胞内沿液泡膜有Ca²⁺分布; ( 5) 受精3~ 4 周后, 果肉细胞中很难检测到Ca²⁺沉淀颗粒, 此状态一直持续到果实采收, 但果实腐烂前Ca²⁺沉淀颗粒沿果肉细胞 壁两侧出现。就Ca2+ 在果实发育中的作用及与细胞超微结构的关系等进行了讨论。     

化肥减量配施鱼蛋白有机液肥对番茄产量和品质的影响

为探讨增施鱼蛋白有机液肥替代化肥的效果,以每667m²施用高钾水溶肥5.0kg为对照,设置每667 m²施用高钾水溶肥3.5 kg+鱼蛋白有机液肥5.0 L、高钾水溶肥2.0 kg+鱼蛋白有机液肥5.0 L、高钾水溶肥0.5kg+鱼蛋白有机液肥5.0L这3个化肥减量处理,比较分析化肥减量增施鱼蛋白有机液肥对番茄生长、产量和果实性状及可溶性固形物含量的影响。结果表明：在每667m²施用5.0L鱼蛋白有机液肥的情况下,减少水溶肥用量会降低番茄的株高、叶长和叶宽,但促进了茎粗、果实纵横径的生长,其中不同处理的果实纵径差异不显著,果形指数和可溶性固形物含量随水溶肥用量的减少先升高再降低,以每667 m²每次追施高钾水溶肥3.5 kg和2.0 kg的果形指数最大,但与其他处理没有显著差异。不同处理的平均单穗坐果数没有显著差异,单果质量和果实纵横径的变化趋势一致,每667 m²每次追施高钾水溶肥0.5 kg的小区产量最大。因此,在追求产量的情况下,果实膨大至采收前以每667 m^2...     

桃PpSnRK1蛋白激酶对植株根系生长的影响

为探讨桃PpSnRK1蛋白激酶对植株根系生长的影响,以桃[Prunuspersica(L.)Batsch]实生苗为试材,通过外源施加水杨酸(SnRK1促进剂)和海藻糖(SnRK1抑制剂)调节植株体内Sn RK1活性,观测其对植株根系构型及活力的影响。从桃叶片克隆到PpSnRKα(Ppa004347m)目的基因,通过农杆菌介导遗传转化获得超表达PpSnRKα拟南芥植株,以T3代纯合株系为试材,观测PpSnRKα对拟南芥根系构型及根系中生长素合成和转运基因表达的影响。结果表明,无论是瞬时还是长期施加水杨酸,桃幼苗根系PpSnRK1α表达量与SnRK1酶活性都上调,且促进了根系生长,提高了根系活力,而施加海藻糖后抑制了根系生长和根系活力,当同时施加水杨酸+海藻糖(1︰1,体积比)后,SnRK1酶活性及PpSnRK1α表达量介于上述两个处理之间,且部分缓解了海藻糖对根系生长的抑制作用。通过观察超表达PpSnRKα拟南芥4-1、4-2、4-3纯合株系的根系可知,SnRK1可以增加根系的长度和密度,特别是增加了侧根的数量;通过RT-qPCR技术分析,超表达PpSnRKα拟南芥的3株纯合株系根系中,无论是生长素合成相关基因(AtTAA1、AtYUC2、AtYUC6),还是生长素运输相关基因(AtPIN1、AtPIN2、AtPIN3)表达量相比野生型均明显上调,且外施0.1 mg·L-1 IAA的野生型株系与3株超表达PpSnRKα拟南芥纯合株系的根系表型相似,根系密度、长度及侧根数量增加,说明SnRK1对植株根系构型的影响与生长素信号途径密切相关,其可以正向调控生长素的合成与转运,进而正向调控根系生长,特别是侧根生长。     

桃钾转运体基因PpeKUP5的表达及功能分析

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。