水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用

广亲和基因S5-n是能够恢复籼、粳杂种育性的基因,利用常规育种方法回交转育广亲和基因需要通过配组杂种F₁,根据F₁的育性判断和选择S5-n,选育周期长,方法繁琐。因此,在广亲和遗传改良和聚合育种中需要寻找一种快速、简便的广亲和基因检测方法。本研究根据水稻广亲和基因和籼粳S-5等位基因序列存在136 bp缺失的特征,设计了InDel标记S5136。前人研究已经明确02428、Dualr、CPSLO17具有S5-n,分子标记S5136 PCR扩增这3个材料的带型为缺失带型,而不携带广亲和基因S5-n的材料的带型为非缺失带型。利用该标记对3037与02428的F₂群体分析表明,该标记能准确区分S5-n、S5-i纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记从554份水稻品种资源(O. sativa L.)和27份普通野生稻(O. rufipogen Griff.)以及24份江淮流域杂草稻资源中筛选出具有缺失带型的资源材料13份,并对其PCR产物测序证实为S5-n,对Kasalath的广亲和性进行了初步验证;从20份02428的高世代育种材料中,筛选到携带广亲和基因S5-n的恢复系2份。该标记可以用于S5-n基因资源筛选、分子标记辅助选择育种和培矮64S为母本的杂交种种子纯度鉴定。     

水稻耐盐性基因SKC1的KASP标记的开发与利用

籼稻品种‘Nona Bokra’中携带的SKC1^NB等位基因水稻耐盐性的主效QTL (Quantitative trait locus)位点。为了提高对水稻SKC1基因型鉴定效率,根据SKC1^NB基因中的功能性SNP位点开发了一个KASP分子标记SKC1^NB-KASP,利用该标记对‘Nona Bokra’与粳稻品种‘繁14’、‘花B’和‘武1B’的回交BC₃F₂群体进行SKC1等位基因的分型,发现在BC₃F₂群体受测的65个单株的DNA样品中,有16份样品的基因型与供体亲本‘Nona Bokra’相同,31份样品显示杂合基因型,18份样品与轮回亲本基因型相同。对这65份DNA样品的,SKC1基因进行测序以检验KASP标记基因分型结果的准确性,发现测序结果与KASP标记分型的结果完全一致。以上结果说明SKC1^NB-KASP标记可以高效、准确地鉴定,SKC1位点的基因型,大大提高了耐盐性水稻分子标记辅助选择育种的效率...     

水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的KASP分子标记开发与利用

含有sbe3-rs基因型的高抗性淀粉含量水稻品种(系)具有调节餐后血糖、改善血脂和增强饱腹感等功效。以‘降糖稻1号’为sbe3-rs基因供体亲本通过杂交育种和回交转育方法培育优质高产高抗性淀粉水稻新品种具有重要意义。sbe3-rs基因第16个外显子的第105位处有T→C的碱基突变,基于该突变位点开发高通量KASP分子标记,利用该分子标记对杂交F₁后代50个单株和回交BC₁F₁后代44个单株共94份材料进行基因分型检测,结果显示50份F₁样品中有47个单株基因型为C/T杂合基因型,44份BC₁F₁群体材料中共有28个单株基因型为C/T杂合基因型。利用已开发的成熟的sbe3-rs的CAPS分子标记检测验证结果完全一致。同时利用开发的KASP分子标记对杂交F₂分离群体进行基因分型鉴定,对应高抗性淀粉基因型单株成熟期收获进行抗性淀粉含量测定,结果完全符合。结果表明针对sbe3-rs的突变位点开发KASP分子标记应用杂交回交群体,克服了前期开发...     

水稻氮高效利用基因NRT1.1B InDel分子标记的开发与应用

水稻NRT1.1B基因是已经克隆并进行功能验证的氮高效利用基因,具有很高的应用价值。根据籼粳稻NRT1.1B基因的基因组序列比对发现,籼型NRT1.1B基因及粳型NRT1.1B基因内含子序列中存在插入/缺失位点。对30个常规籼粳稻的NRT1.1B基因内含子序列进行PCR扩增、测序及序列比对,发现NRT1.1B基因内含子存在6个In Del位点,籼型NRT1.1B基因比粳型NRT1.1B基因缺失55 bp。根据插入/缺失位点设计出In Del分子标记,对15个籼稻常规稻品种、15个粳稻常规稻品种、3个籼粳杂交稻品种及20个F2代育种材料进行NRT1.1B籼粳基因型鉴定。检测实验表明与通过NRT1.1B基因的SNP位点开发的功能标记的检测完全一致。通过该标记可以准确鉴定NRT1.1B基因的纯合籼型、纯合粳型及杂合基因型,该方法成本低、简单、可靠,可用于NRT1.1B基因的鉴定和分子标记辅助育种。     

水稻咪草烟抗性的遗传分析及其紧密连锁分子标记的筛选与应用

抗除草剂水稻的培育及推广能够提高除草效率, 取得巨大经济效益。本研究中金粳818为抗咪草烟资源, 以其与常规粳稻苏垦118杂交产生的F₂群体对抗性基因进行遗传分析与分子定位表明, 其抗性表型受1对显性核基因控制, 位于水稻第2染色体SSR分子标记RM7413和RM7426之间。对该区间候选基因预测和测序发现, 咪草烟靶基因-乙酰乳酸合酶基因(ALS)在重要功能位点发生1个碱基的突变(G变为A), 导致一个氨基酸由丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N), 初步确定ALS是抗性表型的重要候选基因。标记RM7413、RM7426与ALS的物理距离分别为165 kb、1612 kb。以金粳818与南粳9108为亲本, 检测标记RM7413在辅助育种实践中的应用潜力, 对杂交种及其自交后代进行连续表型及标记选择, F₇群体能够稳定遗传抗咪草烟性状, 表明RM7413在粳稻抗咪草烟辅助育种中具有巨大应用潜力。本研究结果为粳稻抗除草剂分子标记辅助改良奠定了基础。     

青稞Wx基因多态性与直链淀粉含量的关系

以150份青稞品种为材料, 采用碘–碘化钾染色法进行表型鉴定, 筛选出含糯性基因型的4份参试材料, 分别是品种IG107028、Puebla、互助双槽人和APM-HC1905。经双波长法测定, 150份参试材料的直链淀粉含量(AC)为12.4%~38.5%, 平均26.0%; 4份糯性参试材料的直链淀粉含量为12.4%~18.6%, 平均16.7%。以直链淀粉含量差别较大的51份材料为模板, 利用引物P4进行扩增, 结果P4引物在51份材料中均有扩增产物出现, 且随着参试材料直链淀粉含量的增大, 其扩增产物的分子量有逐渐增大的趋势, Wx基因位点表现出多态性, 二者呈正相关。根据带型将51份材料分成I型、II型、III型和IV型, 其扩增片段分子量分别为457、481、489和491 bp, 各类型品种的直链淀粉含量分别为12%~27%、29%~30%、31%~35%和36%~38%。P4可作为糯性青稞品种选育的辅助选择标记。     

水稻苗期耐低温基因COLD1新功能标记的设计与验证

籼稻和粳稻在苗期耐低温基因COLD1的第4外显子存在1个功能性单碱基变异SNP2,粳型COLD1 ^Jap等位基因低温耐受性表现更强,具有重要的育种利用价值。通过籼粳杂交,可将粳型COLD1 ^Jap等位基因导入籼稻品种,提高其低温耐受力。为提高COLD1基因的选择效率,根据粳型COLD1 ^Jap与籼型COLD1 ^Ind基因存在的单核苷酸差异,结合扩增受阻突变体系PCR的技术原理设计功能标记。应用5个籼稻品种、5个粳稻品种、1个籼粳杂交F₁个体以及1个籼粳杂交F₂群体对功能标记进行检测验证。结果表明,所设计的功能标记可准确区分纯合粳型COLD1 ^Jap、纯合籼型COLD1 ^Ind和杂合基因型,其扩增带型与基因型完全一致,是一种鉴定COLD1基因的有效方法。该标记弥补了前人设计的衍生型酶切扩增多态性序列功能标记费用昂贵、操作复杂及费工费时等不足,可广泛应用于水稻COLD1基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种。     

亚洲杂草稻红色果皮分子鉴定及其Rc-bHLH序列多态性分析

多数杂草稻的果皮是红色,该特征可用于稻田中杂草稻的早期的初步鉴定,也可用于水稻果皮Rc/rc基因的起源进化研究。本研究利用红色果皮Rc基因第六外显子的In Del标记RID14对来自亚洲不同稻作区的199份杂草稻(O.sativa f.spontanea)、24份栽培稻(O.sativa)和9份野生稻(O.rufipogon)进行基因型鉴定并与表型比对;同时对9份代表性杂草稻Rc-b HLH位点的DNA序列进行测序,并将其与下载的29份栽培稻(籼,粳)和14份野生稻的对应序列进行比对分析。研究结果表明:(1)亚洲杂草稻的果皮颜色的表型多样,多数(84.4%)为红色或褐色(由浅至深)、少数(15.6%)为白色,其基因型与表型鉴定结果高度一致;杂草稻红色果皮Rc基因第六外显子均为无14 bp缺失的类型,仅有一份中国东北杂草稻除外(为14 bp缺失型),揭示用RID14标记可以早期快速的鉴定稻田中红色果皮杂草稻;(2)测试的9份杂草稻其Rc-b HLH位点的DNA序列均较为保守,其中出现4个突变位点;(3)在Rc-b HLH部分区域(1~115 bp),红色果皮的籼型栽培稻、杂草稻和野生稻的DNA序列相同,但红色果皮粳型栽培稻与白色果皮籼型栽培稻和杂草稻在106 bp处存在一个A/G替换;(4)通过对比野生稻和栽培稻,杂草稻在Rc-b HLH位点核苷酸多态性多态性最高,但是野生稻在该位点Tajima'D检验值呈显著,说明Rc-b HLH位点在野生稻中有选择性;通过聚类分析发现分为2个类群,类群1由白色果皮的杂草稻、籼型栽培稻和红/白果皮的粳型栽培稻组成;类群2由红色果皮的栽培稻(籼型)、杂草稻和野生稻组成。该结果暗示:在粳稻区,白色果皮的亚洲杂草稻可能由栽培稻退化返祖而形成的;在籼稻区,红色果皮的亚洲杂草稻可能经由栽培稻及野生稻杂交(如籼籼交或栽野交)演化而来。     

CAPS标记开发及其在D8基因功能标记开发中的应用

本研究以我国160份来源于温带、热带与亚热带玉米自交系为材料,根据已经公布的D8基因序列及已鉴定的677功能位点,开发CAPS标记。结果发现限制性内切酶Bss SⅠ可用于该位点酶切分型,15个样品的分型结果与测序结果完全一致;利用开发的CAPS标记,对160份玉米自交系D8基因677位点进行基因分型,结果表明在160份自交系中共有151份能扩增出清晰条带,在9份自交系未扩增到条带;20份自交系D8基因677位点基因型为G型,131份自交系基因型为C型。该结果与Thornsberry等(2001)研究结果中该位点基因型的趋势一致,D8基因677位点开发的CAPS标记可用限制性内切酶快速检测,在玉米分子育种中有潜在的利用价值。     

水稻稻瘟病抗性基因Bsr-d1功能标记的开发和利用

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一, 选育抗病品种是防治该病害最有效的方法。Bsr-d1是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。为提高Bsr-d1基因在育种中的选择效率, 根据Bsr-d1与其感病等位基因bsr-d1在功能区域存在的单核苷酸差异, 设计和筛选出Bsr-d1基因不同类型的基因功能标记CAPs5-1和3Bsr-d1/3bsr-d1, 结合测序分析验证, 可准确鉴定出Bsr-d1的不同基因型。利用3Bsr-d1/3bsr-d1对34份籼稻品种、江苏历年来主要推广的110份粳稻品种、其他省份的13份粳稻品种、148份太湖流域地方粳稻资源和19份太湖流域地方籼稻资源进行了Bsr-d1基因型检测, 筛选到携带Bsr-d1基因的籼型资源11份, 271份粳型资源中均不携带Bsr-d1基因, 这也说明Bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中, 在粳型资源中几乎不存在。本研究为Bsr-d1基因的育种利用和分子标记辅助选择奠定了基础。     

青藏高原青稞农家品种淀粉颗粒结合蛋白组成及GBSSI基因5′前导序列的多态性

利用1D-SDS-PAGE分离了261份青藏高原农家青稞的淀粉颗粒结合蛋白,旨在为青藏高原青稞淀粉品质改良和淀粉颗粒结合蛋白机制研究提供依据和基础信息。在分子量45~100 kD区域共有20种多态性蛋白条带和78种组合带型,其中2、3、5、10、11为新条带。利用PCR技术克隆了236份农家青稞GBSSI基因5′前导序列,出现1 000 bp和800 bp的多态性片段,且以前者为主,其频率为80.1%。在8份农家青稞及4份引进的低直链淀粉材料的GBSSI基因5′前导序列中共检测到32个多态性位点,包括9个InDel和23个SNP。GBSSI基因5′前导序列中出现了特有的序列差异,如未出现600 bp类型(约400 bp的特异缺失),而该缺失被认为是低直连淀粉大麦形成的原因;材料yf127、yf70、011Z1396和09Z586出现了特异点突变。因此认为,青藏高原农家青稞品种的淀粉颗粒结合蛋白具有丰富的多态性和独特性,可能存在新的形成机制。     

基于PCR标记的陕西省部分地方小麦品种(系)糯蛋白基因的多样性分析

利用3个优化的STS标记对陕西省1960年以来引进和自育的99份小麦品种(系)的Waxy蛋白基因的变异情况进行了鉴定.结果表明,Wx-A1位点的标记在Wx-A1a和Wx-A1b基因型内分别扩增出336 bp和317 bp特异片段；Wx-B1a基因型内扩增出425 bp特异产物,Wx-B1b基因型内不扩增出此产物；Wx-...     

谷子糯质基因共分离分子标记的研究

为得到一种鉴别糯质谷子的分子标记方法,用于优质谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育。通过对糯性谷子十里香与梗性谷子豫谷1号配制的F2群体的F3种子胚乳进行碘液检测,结果显示:深蓝色与棕红色胚乳单株数的比例符合3∶1,说明糯质对梗质是由单基因控制的隐性性状。利用糯质分型引物对十里香基因组进行PCR扩增和产物测序,结果表明,十里香的糯性是由Ⅳ型糯质基因控制,即由TSI-2转座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)内元1形成。根据该糯质基因设计出2对In Del标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R,扩增谷子基因组DNA,若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段,则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。最后,利用该标记组合从100份谷子资源中鉴定到2份属于Ⅳ型糯质基因控制的糯质材料。可见,该标记组合可以准确鉴别谷子Ⅳ型糯质基因。     

薄皮甜瓜果皮花斑性状的InDel-spot分子标记开发和应用

为了提高薄皮甜瓜的果皮花斑和非果皮花斑性状育种材料的选择效率,笔者采用田间提供的薄皮甜瓜的果皮花斑材料和非果皮花斑材料进行了研究,于2号染色体上控制甜瓜果皮花斑的基因附近重新开发连锁的InDel-spot分子标记,利用InDel-spot标记对20份薄皮甜瓜材料进行基因检测。结果表明,果皮花斑条带大小约211 bp,而果皮非花斑条带大小约219 bp,且符合率达到95%;进一步利用InDel-spot标记对2个F₂群体及5个F₃群体进行果皮花斑的鉴定,其中Qb978(F₂)、Qb931(F₃)和Qb932(F₃)的检测准确率分别96.6%、91.7%和83.3%。该InDel-spot分子标记在甜瓜果皮花斑的实际鉴定中具有重要的实践运用,可以针对性地提高育种材料选择的效率,缩短育种周期。     

水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因ALS功能标记的开发与应用

选育和利用抗除草剂水稻品种具有重要的生产实践意义。通过筛选水稻资源, 发现了抗除草剂材料金粳818, 其ALS基因编码区第1880位碱基存在一个由G到A的碱基变异, 导致丝氨酸突变为天冬酰胺, 从而具有除草剂抗性。本研究基于该位点的碱基变异, 设计了11条等位基因特异PCR (allelic-specific PCR, AS-PCR)引物, 经过优化筛选, 获得两个引物组合F1N (S1/S9)和F1M (S1/S10), 将该标记命名为AS-ALS。利用F₂群体及其亲本和杂交种, 结合AS-ALS标记检测和除草剂抗性分析, 结果表明感除草剂ALS-G等位基因型只能被F1N引物对有效扩增, 抗除草剂ALS-A等位基因型只能被F1M引物对有效扩增, 而杂合基因型能同时被两对引物F1N和F1M扩增, ALS-A纯合或杂合等位基因型都表现抗除草剂, ALS-G纯合基因型表现感除草剂。因此本研究开发的标记能有效区分除草剂抗性基因的3种基因型, 基因型与表型完全对应。该标记用于回交育种, 可以选择ALS-A杂合基因型单株, 剔除ALS-G纯合等位基因型, 在自交的F₂保留ALS-A纯合基因型单株, 连续自交, 能快速获得除草剂抗性稳定的水稻材料。该除草剂抗性基因的功能标记还可用于咪唑啉酮类除草剂抗性资源筛选。     

豫粳6号B与TR2604间杂种花粉不育基因的定位

阐明BT型杂交粳稻组合间育性差异的遗传基础有助于三系法杂交粳稻组合的选育。根据TR2604与豫粳6号A(B)、9201A(B)后代的花粉育性及小穗育性,明确了豫粳6号A(B)/TR2604 F₁不育由双亲间特异性不亲和造成。遗传分析表明豫粳6号A(B)与TR2604 F₁花粉不育受单基因S38(t)控制。以352株豫粳6号A/TR2604//TR2604、豫粳6号B/TR2604//豫粳6号B等群体中单株为定位群体,将S38(t)定位于第7染色体上标记RM18和RM234之间,与两标记遗传距离分别为0.43 cM和0.14 cM,两标记间物理距离为180 kb,相关结果为S38(t)图位克隆工作奠定了基础。     

抗大豆胞囊线虫SCN3-11位点的KASP标记开发和利用

大豆胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)是严重危害世界范围大豆生产的害虫, 采用合理轮作和种植抗病品种可有效控制损失。为了开展分子标记辅助选择以加速抗病品种培育, 本研究针对前期发现的与大豆胞囊线虫3号小种(SCN3)抗性显著关联的非同义变异SNP位点Map-5149, 开发高通量、低成本的新型分子标记—竞争性等位基因特异PCR标记(kompetitive allele specific PCR, KASP), GmSNAP11-5149。利用GmSNAP11-5149鉴定了来自8个国家的202份代表性大豆抗感资源, 发现141份材料携带抗病基因型GmSNAP11-5149-AA, 平均雌虫指数为6.2%, 极显著低于58份携带感病基因型GmSNAP11-5149-GG材料的雌虫指数(61.1%), 方差分析表明, GmSNAP11-5149与胞囊线虫的抗性显著相关(F=44.18, P<0.0001), 对抗病材料的选择效率达到92%, GmSNAP11-5149可作为一个实用的分子标记应用于辅助抗大豆胞囊线虫品种选育和抗病种质资源鉴定。     

水稻Ra基因的分子标记开发及应用

本研究通过对黑米(豫南黑籼糯)和紫叶白米(IR1552)Ra基因的测序,共找到了3个序列多态性位点。黑米的第10外显子存在2 bp缺失,紫叶白米的第2外显子(5'-UTR区)存在8 bp缺失,紫叶白米的第6内含子存在30 bp缺失。根据这3个多态性位点,分别设计了3对共显性分子标记Ra Marker1、Ra Marker2和Ra Marker3。将它们分别应用于黑米和白米重组自交系的筛选和验证,发现黑米的Ra基因型表现为Ra/Ra,白米的基因型表现为ra/ra,褐米的基因型表现为Ra/Ra或ra/ra。再加上该基因和黑米色素调控基因紧密连锁,因此这3个分子标记是黑色种皮的可靠标记,可进一步用于分子标记辅助育种的实践中。通过对Ra表达情况分析,发现该基因的2 bp缺失仅存在于黑米和褐米的c DNA中。通过实时定量PCR研究,发现该基因在黑米和褐米中存在一定的时空表达差异性。     

利用分子标记鉴定水稻品种的Wx等位基因及其与直链淀粉含量的关系

应用Wx基因的微卫星标记484/485和PCR-AccⅠ分子标记对93份籼、粳水稻品种（系）的Wx基因的多态性进行了研究,并探讨了不同基因型与直链淀粉含量的关系。484/485扩增结果表明,该微卫星标记表现为3种基因型,即Wx1Wx1、Wx2Wx2和Wx3Wx3,其中籼稻以Wx1Wx1和Wx3Wx3为主,粳稻以Wx2Wx2为主,具有Wx1Wx1和Wx2Wx的品种（系）直链     

小麦Wx基因近等基因系的创制及其对直链淀粉含量、面条感官品质的影响

为明确不同Wx基因对小麦直链淀粉含量的影响以及筛选面条品质优异的基因型,以糯小麦品系Caiwx (aabbdd)为3个Wx基因隐性突变供体亲本,以扬麦01-2 (AABBDD)为轮回亲本,利用连续回交结合花粉碘染、STS标记和同工酶标记检测方法,创制了8种Wx基因纯合基因型的近等基因系,其基因型分别为AABBDD、AABBdd、AAbbDD、AAbbdd、aaBBDD、aaBBdd、aabbDD和aabbdd。利用这些基因型探讨了不同Wx基因对直链淀粉含量及面条感官品质的影响。结果表明,各系的直链淀粉含量为0.9%~24.8%,系间差异显著;糯小麦型(aabbdd)直链淀粉含量最低,双缺失型和单缺失型其次,双缺失型中aaBBdd型含量最高,单缺失型中AAbbDD型含量最低,表明Wx-B1对直链淀粉的合成作用最大。糯小麦型面条的色泽、表观、软硬度、黏性、韧性得分以及总分显著低于其他类型及轮回亲本扬麦01-2;单缺失型面条的色泽、表观得分、总分显著高于轮回亲本扬麦01-2,其中aaBBDD型面条品质表现突出,与市售优质面条粉“雪花粉”制作的面条得分相当,而其他7种基因型及轮回亲本扬麦01-2的面条评分均显著低于雪花粉。说明可以通过遗传操作Wx基因培育优质面条小麦品种。