小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦绒毡层退化基因（Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like）,研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础。【方法】以普通小麦品种西农1376（MF-XN1376）为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况。【结果】成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点（pI）分别为4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100%,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96%,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98%和88%;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和拟南芥AMS（AT2G16910.1）的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表达量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核。【结论】TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性。     

小麦TaAlaAT基因的克隆及镉胁迫下表达分析

为了研究AlaAT基因在小麦应对镉胁迫中的功能,以镉处理小麦为试验材料,利用mRNA差异显示技术DDRT-PCR、RT-PCR从小麦cDNA中克隆得到AlaAT基因全长,将其命名为TaAlaAT。用生物信息学方法对TaAlaAT的基因序列和蛋白质氨基酸序列进行分析,进一步用MEGA 6.0软件构建进化树;用qRT-PCR研究TaAlaAT基因在小麦不同组织中以及镉胁迫后的相对表达水平。序列分析结果表明,该基因全长为1 628 bp,包含1个长度为1 440 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),其编码479个氨基酸,蛋白质分子量约为53.41 ku,等电点为6.97,该蛋白质属于天冬氨转氨酶家族,与水稻(Oryza sativa L.)AlaAT蛋白的相似性较高。qRT-PCR结果表明,TaAlaAT在小麦中具有组织特异性,在根部的表达水平最高,在镉胁迫处理后,TaAlaAT基因表达量呈现先升高后降低的趋势。由研究结果可以看出,TaAlaAT基因能够响应镉胁迫。     

甘薯Iborf56基因的克隆与表达分析

为了研究甘薯叶绿体基因Iborf56的表达是否受到盐胁迫的诱导以及对生长发育的影响,为甘薯的品种选育提供参考,以栗子香为研究材料,从中克隆Iborf56基因,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征,亚细胞定位预测、系统发育分析、调控元件分析、不同组织及盐胁迫表达模式,以及qPCR验证该基因的表达量。结果表明,Iborf56与已知序列相似度为99.28%,开放阅读框长度为929 bp,编码60个氨基酸,含有8个磷酸化位点,没有信号肽和跨膜区,不具有分泌蛋白的特性,主要由α-螺旋组成;亚细胞定位在叶绿体基质中;进化树分析表明,Iborf56与三浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）和三裂叶薯（Ipomoea triloba)的遗传距离最近;启动子元件分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、抗逆和激素应答等功能元件。转录组以及实时荧光qRT-PCR定量分析表明,Iborf56在甘薯叶片中的表达量最高且随生长时间增加呈显著上升趋势,推测该基因参与甘薯的生长发育;此外,Iborf56基因的表达量随盐胁迫时间表现为先升后降的趋势,且该基因在盐胁迫下12 h时达到了临界值,暗示其可能参与甘薯盐...     

小豆抗病相关基因VaAC1的克隆与表达分析

利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段,命名为VaAC1,通过RACE技术延伸VaAC1基因的3’端和5’端,VaAC1基因完整ORF长度为885 bp,编码294个氨基酸,拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18_chitinase-like。RT-PCR分析表明,VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达相对较高;大豆花叶病毒处理后,VaAC1基因在叶中的表达量显著增强,显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。     

花生生长素输入载体基因PNAUX1的克隆及表达模式分析

生长素作为重要的植物激素,在调节植物生长发育中起重要作用。其所具有的极性运输特性,主要通过运输载体进行调控。本研究从花生未成熟种子cDNA文库中筛选到一个可能的生长素输入载体AUX/LAX类基因,命名为PNAUX1,通过RT-PCR对其表达模式分析显示,该基因在花生各组织中为组成型表达;同时,将PCR扩增获得的目的片段与植物双元表达载体pCAMBIA1301连接,构建了正义和反义载体转化DR5∷GUS拟南芥,并获得转基因植株。     

大白菜GID1家族基因鉴定及表达模式分析

GID1蛋白是赤霉素信号转导过程中的重要受体,在调控植物生长发育过程中发挥重要作用。本研究采用生物信息学分析方法对大白菜基因组中GID1家族基因进行鉴定,并对该基因结构、染色体分布、系统进化以及表达模式等进行分析。结果表明,大白菜基因组中含有5个GID1家族成员,分别位于4、5、6、7、9号染色体上,各成员都只含有1个内含子。系统进化结果显示,单子叶和双子叶植物的GID1蛋白明显处于两个不同分支,大白菜GID1家族成员与拟南芥GID1具有更近的亲缘关系。通过表达模式以及启动子顺式响应元件分析发现,大白菜GID1基因不仅参与生长发育调控还可能参与对不同环境因子的响应过程。     

枣SEP1基因的克隆和表达分析

SEP类基因属于E类MADS-box基因,在植物花器官发育中发挥重要作用。该研究以‘冬枣’为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术从枣中分离到1个SEPALLATA1基因,并进行生物信息学及转录表达分析。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框为735bp,编码244个氨基酸,预测分子量为27.9247kDa。系统进化树显示,该蛋白与其他植物SEP1类蛋白具有较高的同源性,命名为ZjSEP1(登录号为:KU375248)。实时荧光定量分析表明,ZjSEP1在枣不同组织中表达有显著差异,在蕾、花、幼果等生殖器官中高丰度表达,尤其是花发育前期表达最高;该基因在雄性不育和可育品种中表现出不同的表达模式,初步认为ZjSEP1基因可能在枣花器官的形成过程中发挥一定调控作用。     

小麦MYB基因的表达分析

MYB转录因子在植物生长发育和响应外界环境胁迫中发挥着重要的作用。为了分析小麦MYB基因在小麦不同组织中的表达特性,采用半定量RT-PCR方法研究了小麦MYB基因在根、茎和叶中的表达。结果表明:MYB的转录本在3个组织中均有表达,在根中MYB表达量最高,叶中表达量最低。     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

为了研究小麦NAC转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应,本试验克隆了小麦的TaNAC-B072基因。该基因的开放阅读框长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白,具有1个NAC结构域。多序列比对和系统进化树分析显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。RT-PCR结果显示,在小麦的根和地上部分,TaNAC-B072基因的表达受高盐、渗透和冷胁迫的诱导,初步推测基因TaNAC-B072可能与小麦响应逆境胁迫有密切的关系。     

小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

为了研究小麦NAC转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应,本试验克隆了小麦的TaNAC-B072基因。该基因的开放阅读框长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白,具有1个NAC结构域。多序列比对和系统进化树分析显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。RT-PCR结果显示,在小麦的根和地上部分,TaNAC-B072基因的表达受高盐、渗透和冷胁迫的诱导,初步推测基因TaNAC-B072可能与小麦响应逆境胁迫有密切的关系。     

小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析

GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE, repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明：TaPAT1-2D序列全长1 668 bp,编码555个氨基酸,分子量约为61.34 ku; TaPAT1-2D蛋白含有典型GRAS功能结构域,在进化关系上与水稻OsCIGR2(LOC＿Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量PCR结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液72 h后,TaPAT1-2D基因在4个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬...     

小麦水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用,采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得 TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp,共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域,为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达,在茎中表达量最高。在PEG胁迫下,该基因的表达量下调,表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H₂O₂胁迫下,表达量先下调后上调,推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。     

枸杞LbMYB1基因的克隆与表达分析

在前期的枸杞花药蛋白质组学研究鉴定差异表达蛋白的基础上,采用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆了一个花药发育差异表达MYB类蛋白基因。生物信息学分析表明,该基因编码R2R3类MYB转录因子的典型结构域,与其他物种MYB蛋白的氨基酸的相似性达72%以上,属于R2R3类MYB蛋白基因家族。将该基因命名为Lb MYB1,Lb MYB1包含一个975 bp的开放阅读框,编码324个氨基酸残基,分子量79.2 kv,等电点为4.95。实时定量RT-PCR检测表明,Lb MYB1基因在花药四分体形成时期高丰度表达,在花中的表达量也较高,果实中表达量较低,在根、茎及叶中未检测到表达,推测Lb MYB1基因可能与花药发育中有关。本研究为后继进一步探讨Lb MYB1蛋白在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能及其分子机理提供参考。     

鲫鱼Vitellogenin基因的克隆与组织表达分析

为研究鲫鱼不同卵黄蛋白原(Vtg)亚型基因生物学功能及其分子机制,克隆鉴定了鲫鱼中Vtg同源基因的2种亚型,分别命名为Ca-VtgAo1和Ca-VtgC.Ca-VtgAo1和Ca-VtgC cDNA序列全长分别为4241 bp和4207 bp,开放阅读框(ORF)分别为3873 bp和3612 bp,5'非编码区(UT...     

罗氏沼虾Dmc1基因的克隆及表达分析

DNA减数分裂重组酶1基因(disrupted meiotic cDNA 1,Dmc1)是在减数分裂过程中特异表达的基因。为了研究罗氏沼虾卵巢发育的分子机制,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得罗氏沼虾Dmc1基因的全长cDNA序列(MrDmc1),并对MrDmc1基因编码的蛋白进行理化性质、亲疏水性、亚细胞定位以及蛋白质结构等生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术检测Dmc1基因在卵巢、肌肉等组织中的表达量。结果显示,MrDmc1基因的ORF全长1 026 bp,共编码341个氨基酸;MrDMC1蛋白分子量为37.4 ku,该蛋白没有跨膜区域和信号肽切割位点,含有1个N-糖基化位点和25个磷酸化位点,是亲水性蛋白,主要存在于细胞质中。系统进化树发现,罗氏沼虾MrDmc1基因与克氏原螯虾、凡纳滨对虾等甲壳类动物进化关系较近。荧光定量PCR结果显示,MrDmc1基因在7种组织中均有表达,在心脏中表达量最高,在眼中表达量最低;MrDmc1基因的表达量在卵巢发育过程中呈先升高后降低的趋势,在卵巢发育Ⅱ期的表达量最高。研究表明,MrDmc1基因参与了罗氏沼虾卵巢发育的调控,推测...     

小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达

自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。NBR1是选择性自噬的底物受体之一,其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上,本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中,利用SDS-PAGE方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG诱导表达;表达重组蛋白两端含有His(6)标签,其表观分子量与理论分子量基本一致;重组蛋白在诱导后2 h即表现较高的表达量,并在诱导后4 h达到最高的表达量。研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。     

小麦PIN基因家族的鉴定及表达分析

【目的】PIN(puroindoline)是植物所特有的一类蛋白家族,对控制小麦籽粒硬度有重要功能。分析小麦PIN家族成员在全基因组的分布、结构及进化,研究其在不同组织的表达特异性以及在不同硬度种子的表达模式,为阐明小麦PIN基因家族的生物学功能奠定基础。【方法】根据已报道的小麦PIN基因和大麦HIN基因,利用BLASTP和HMM方法,在最新发布的小麦中国春参考序列中鉴定小麦PIN基因家族成员。利用UniProt、URGI、PFAM、CDD、expVIP等数据库,采用Clustal X、MEGA 7.0、ExPASy、MEME、GSDS、TB tools、GraphPad Prism5等软件进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法检测TaPIN基因家族在不同籽粒硬度小麦样品中的表达情况。【结果】共鉴定出19个小麦PIN基因,集中成簇分布于第1、5和7染色体同源群,编码148—327个氨基酸,编码蛋白相对分子量为16.39—37.19 kD,等电点为6.35—9.34。通过结构域和系统发育分析,可将19个TaPIN基因分为A和B两大类。大部分TaPINs基因仅有1个外显子,没有内含子,...