甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。     

甘蔗易化子家族蛋白Sc ZIFL1与6K2互作应答SCMV侵染

易化子超家族转运蛋白(major facilitator superfamily,MFS)在生物中普遍存在,锌诱导类辅助因子(zinc induced facilitator like,ZIFL)是MFS成员,参与小分子有机物运输。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharum spp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的ZIFL,命名为Sc ZIFL1。本研究利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)进一步验证了Sc ZIFL1与SCMV-6K2的互作。生物信息学分析表明,Sc ZIFL1长度为484个氨基酸,无信号肽,具有12个跨膜结构域,为不稳定的疏水性蛋白。序列比对分析表明,Sc ZIFL1具有MFS保守的半胱氨酸模体、特征基序及反向运输基序。系统进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物之间,以及单子叶C3植物和C4植物之间存在明显分化。亚细胞定位试验表明,Sc ...     

甘蔗PsbS亚基应答甘蔗花叶病毒侵染及其与6K2蛋白的互作研究

非光化学猝灭(non-photochemical quenching,NPQ)是高等植物主要的光保护调节机制,光合系统Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)的Psb S亚基在NPQ起关键作用。甘蔗(Saccharum spp.hybrid)中PSⅡPsb S亚基应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的侵染尚未见报道。本课题组在前期研究中克隆了甘蔗的Psb S亚基编码基因,命名为Sc Psb S,该基因开放读码框(open reading frame, ORF)长度为798 bp,编码长度为265个氨基酸的蛋白。生物信息学分析表明, Sc Psb S为稳定的疏水性蛋白,具有叶绿体定位信号,有4个跨膜结构域;具有典型的Psb S亚基结构域。系统进化树分析表明, Sc Psb S在单子叶、双子叶以及单子叶的C3和C4植物中存在明显的分化。亚细胞定位分析表明,Sc Psb S定位于叶绿体且与SCMV-6K2部分共定位于叶绿体。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验进一步证实了ScPs...     

玉米与矮花叶病毒互作对防御反应酶系活性的影响

选取抗、感甘蔗花叶病毒-玉米矮化株系的玉米自交系黄早四和Mo 17,与国内流行的甘蔗花叶病毒-玉米矮化B株系组成的非亲合性和亲合性互作体系为研究对象,以未接种为对照,对两类互作类型的防御反应酶系中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物岐化酶(SOD)活性变化规律进行系统研究.非亲合性互作中PAL活性始终高于对照,整个互作过程中形成两个较大的峰,亲合性互作中除96 h高于对照外,其它时间均比对照低;非亲合性互作中POD活性先升后降,形成1个明显的峰值,亲合性互作中POD活性与对照相比没有明显变化,144 h形成1个明显酶活高峰;非亲合性互作体系中多元酚氧化酶除24 h外,酶活性均高于对照,形成1个酶活高峰,亲合性互作中酶活与对照相比没有较大变化;非亲合性互作中CAT活性始终低于对照,亲合性互作中在接种24～120 h内形成两个酶活高峰均高于对照;非亲合性互作中SOD活性先降后升,72 h达到酶活高峰,亲合性互作中变化趋势与非亲合性互作相似,酶活高峰出现在120 h.     

甘蔗类泛素蛋白UBL5应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharumspp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的类泛素蛋白UBL5,命名为Sc UBL5,长度为73aa。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步证实了Sc UBL5与SCMV-6K2互作;生物信息学分析表明, Sc UBL5为稳定的亲水性非分泌蛋白,无信号肽和跨膜结构。系统进化树分析表明, Sc UBL5具有明显的种属特异性。亚细胞定位分析表明,Sc UBL5定位于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,Sc UBL5基因的表达具有明显的组织特异性,在完成形态建成的正一叶、第7叶、根和第8节间...     

小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作

从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经8 mol L^-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性。将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。     

烟草质子泵互作蛋白NTPpi1基因的克隆及其生物信息学分析

为了能够更好地选育高钾烟草品种,本研究根据烟叶钾元素含量全基因组关联分析结果,克隆了烟草质子泵互作蛋白NTPpi1的基因序列。生物信息学分析发现,NTPpi1基因长度为1 834 bp,开放读码框为981 bp,编码的蛋白质序列由326个氨基酸组成;蛋白质分子量为145.3 kD,蛋白质等电点为5.00;通过在线软件TMHMM 2.0 Server预测发现,该蛋白存在一个跨膜的螺旋结构,且跨膜长度有23个氨基酸。氨基酸序列多序列比对分析结果显示,NTPpi1的氨基酸序列与其他植物Ppi1氨基酸序列的一致性为80.82%。通过NetPhos 3.1 Server软件对质子泵互作蛋白NTPpi1的磷酸化位点进行预测,发现有29个可以磷酸化的位点,其中第321位的Threonine磷酸化位点位于跨膜区域,推测这个位点可能是该蛋白与ATP酶质子泵相互作用的位点。以上结果的发现为高钾烟草品种的选育提供一定的理论支持。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

槟榔黄叶病毒1外壳蛋白的互作蛋白筛选

为明确槟榔黄化病致病机理,探究槟榔黄叶病毒1 (areca palm leaf yellowing virus 1, APLYV 1)病毒与宿主蛋白之间相互作用的机制,本研究以槟榔叶片为材料,构建槟榔cDNA酵母双杂交文库,以APLYV 1的外壳蛋白(coat protein, CP)为诱饵,构建诱饵载体pGBKT7-CP,采用酵母双杂交技术,从槟榔cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果表明,成功构建槟榔酵母文库,文库容量达1.1×10⁷以上,重组率为100%,插入片段平均长度>1 000 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-CP,通过自激活实验检验,阳性对照在四缺培养基平板上能正常长菌且显蓝,阴性对照和实验组在二缺培养基平板上能正常长菌,在三缺和四缺培养基平板上未长菌,表示构建成功的重组诱饵载体无自激活活性,可用于筛库实验。共筛选出13个阳性克隆,经NCBI网站与槟榔转录组库进行比对,最终得到10个候选槟榔蛋白,包含sHSP (small Heat Shock Protein)与DnaJ蛋白等。选择DnaJ蛋白,通过理化性质分析和蛋白二级结构预测,发现该槟...     

气象因素对甘蔗生产的影响及环境互作基因研究进展

甘蔗产量与蔗区的自然条件、生产条件、耕作制度、栽培管理技术措施和品种特性有密切关系,而与气象因素也息息相关。降雨量对甘蔗伸长期,成熟期有关键影响,与产量有正相关关系,挖掘利用不同作物的抗旱基因,可以提高甘蔗抗旱能力。大气相对湿度、温度、光照是影响甘蔗伸长、糖分累积和单产的重要因素。甘蔗的产量和含糖量受干旱、台风、洪涝灾害、低温高湿等气候因子的影响。本研究通过分析蔗区降水量、湿度、日照等气象因素对甘蔗产量的影响,结合甘蔗抗逆基因的研究进展,提出发展分子标记用于辅助选择甘蔗育种,研究不同灾害性天气对甘蔗产量性状之间的影响,对于甘蔗的生产有着指导性意义和巨大的经济意义。     

拟南芥LBD15互作蛋白的筛选和鉴定

为了进一步挖掘拟南芥LBD逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究拟南芥逆境胁迫响应机理,将前期筛选到的LBD15基因构建到pGBKT7酵母表达载体上,筛选与LBD15互作的蛋白。利用酵母双杂交技术筛选了拟南芥全长均一化的酵母文库,在本次筛库试验中,146个样有107个测出序列,通过NCBI Blast分析,其中有96个获得了基因号,占总数的87.9%。根据基因号进行分类,得到了48个蛋白,在筛选到的48个蛋白中有59%的蛋白都是有重复的。然后把基因号通过网站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列,通过亚细胞定位预测网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)分析其亚细胞定位,定位分析结果表明,这些蛋白主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。利用Blast2GO进行Gene Ontology注释显示互作蛋白共参与了14个生物过程,包括细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控、单组织和多组织过程及发育进程调控等。对得到的可能互作蛋白随机挑选了5个进行了互作蛋白的分离和回复验证,结果发现,AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长,进一步证实了其为互作蛋白。酵母双杂交文库的成功筛选为进一步研究拟南芥LBD15的分子作用机制奠定了基础。     

水稻胞质不育相关蛋白ORF290及互作蛋白对酵母生长的影响

orf290是本实验室从红莲型水稻细胞质雄性不育品种‘粤泰A’(YTA)中克隆的一个与雄性不育相关的线粒体基因,前期通过膜蛋白酵母双杂交获得了2个与ORF290互作的蛋白APX8和E37。为探讨ORF290与APX8和E37发生相互作用时对酿酒酵母NMY51生长的影响,本实验利用膜蛋白酵母双杂交DUAL membrane系统,分别将诱饵蛋白和互作蛋白基因构建到pBT3-SUC-和pPR3-N-载体上,获得pBT3-SUC-orf290、pPR3-N-APX8和p PR3-N-E37质粒,然后分别单转和共转(pBT3-SUC-orf290与pPR3-N-APX8, pBT3-SUCorf290与pPR3-N-E37)酵母NMY51菌株。在RNA和蛋白水平分别证实相关基因在转化酵母中高效表达,并且相关蛋白以膜蛋白的形式存在。含不同质粒酵母生长曲线测定结果表明,宿主菌NMY51、单独转化pBT3-SUC-orf290、p PR3-N-APX8和pPR3-N-E37的NMY51酵母生长曲线相近,体内ATP含量无明显差异,而共表达ORF290与APX8或E37的酵母菌株的生长明显低于对照组,AT...     

软枣猕猴桃LDOX基因结构特征分析及蛋白互作网络构建

本研究为揭示软枣猕猴桃中无色花色素双加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase, LDOX)基因结构及其功能。运用生物信息学方法对软枣猕猴桃LDOX核苷酸及氨基酸序列进行深入分析,构建LDOX基因的蛋白互作网络,并进行GO及KEGG功能注释分析。结果显示:软枣猕猴桃与野茶树、以南高丛蓝莓、蓝莓、金银花及胡萝卜亲缘关系较近,含有10个保守基序。顺式调控元件主要参与ABA信号途径、响应干旱应答,厌氧诱导、赤霉素、生长素响应因子、Me JA反应、低温响应、光刺激应答响应元件。LDOX理化性质及结构分析表明,其为亲水性蛋白,未发现信号肽及跨膜结构区域,主要包括Ser磷酸化位点(13个)、Thr磷酸化位点(12个)及Tyr磷酸化位点(6个)。含有两个O-糖基化位点(Thr4和Thr323),并且在107～109残基位置存在Asn107N-糖基化位点。48～347 bp处含有2-酮戊二酸-Fe2+-双加氧酶家族(20G-FeⅡOxy)保守结构域,二级结构主要以无规则卷曲(43.10%)为主。LDOX和F3H、UFGT、FLS及PAL等蛋白之间存在一定互作关系,参与类黄酮生物合成及代谢过程,主要在植物型液泡膜中发挥作用,并且具有调控催化活性及氧化还原活性分子功能。LDOX基因高度保守,在类黄体酮通路中发挥重要的调控作用,为进一步深入探讨软枣猕猴桃LDOX基因功能机制提供了理论依据。     

微生物效应蛋白在植物-微生物互作中作用的研究进展

微生物效应蛋白在植物与微生物的相互作用过程中发挥种间的信息交流功能,起到重要的桥梁作用。它通过抑制植物受体诱导的免疫、调控植物基因转录、酶激活或抑制等方式为微生物侵染植物提供便利。不同类型微生物效应蛋白发挥的功能不同,作用方式和分子机制也不尽相同,且研究状况存在一定的差异,本研究通过回顾近些年来微生物效应蛋白的研究结果,对其在细菌、真菌、卵菌等病原菌及有益共生菌侵染宿主过程中的作用和分子机制进行总结,为植物-微生物相互作用机制深入研究提供相关理论依据。     

侵染甘蔗的高粱花叶病毒遗传多样性分析

为探明甘蔗花叶病的病原病毒之一高粱花叶病毒(sorghum mosaic virus, SrMV)在我国华南地区的发生情况,从广东省广州、翁源、博罗及广西南宁等地甘蔗产区采集表现花叶症状的甘蔗叶片样品,采用1对病毒CP基因引物(P1:5′-ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC-3′、P2:5′-CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC-3′,Y=C/T,W=T/A,K=G/T,R=A/G),进行一步法RT-PCR检测,结果表明48%的样品受到SrMV侵染。根据寄主类型和地理来源,选取10份代表性样品,对经P1、P2扩增获得的病毒CP基因片段进行直接测序,所得序列经Blast比对确认均为SrMV CP序列。为揭示SrMV种内的遗传多样性,采用Clustal W方法对本文鉴定的10个SrMV分离物与GenBank中已报道的全部18个SrMV株系或分离物的CP基因序列进行多序列联配,并计算核苷酸同一性,结果显示各个SrMV分离物之间的CP基因核苷酸同一性为76%~100%。基于病毒CP基因核苷酸同一性的遗传多样性分析,SrMV种内分化成2个遗传变异类群,即杂种甘蔗组(HS group)和高贵甘蔗组(NS group),它们的分离物大多分别来自杂种甘蔗(hybrid sugarcane)寄主和高贵甘蔗(noble sugarcane)寄主。分离物之间的平均CP基因核苷酸同一性,在两组组内分别为87%和90%,两组间为80%。说明两组SrMV之间存在较大的遗传差异,寄主隔离是导致该病毒种内分化的主要因素。因此,在甘蔗花叶病的防治和抗病毒育种工作中,除需注意病原的种类和寄主类型外,还应充分考虑病原种内的遗传多样性。     

西瓜减数分裂相关基因ClSPO11-1的互作蛋白筛选

减数分裂是有性生殖的关键过程.Ⅱ型拓扑异构酶SPO11是在植物减数分裂过程中起重要作用的一类酶,然而,该类酶在减数分裂过程中的具体分子作用机制目前尚有待鉴定.本研究以西瓜花蕾cDNA为模板,首次克隆获得西瓜拓扑异构酶基因ClSPO11-1的CDS全长1 095 bp,编码394个氨基酸.为了进一步研究ClSPO11-1...     

酵母双杂交系统筛选马铃薯StMAPKK1互作蛋白及其生物信息学分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是参与植物生长发育、激素及胁迫的响应信号通路中重要而复杂的信号网络之一.促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)是其主要成员之一,是该级联反...     

花生AhHDA1互作蛋白AhGLK的筛选及特性分析

通过酵母双杂交系统,以花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1为诱饵,对花生cDNA文库筛选并分析互作蛋白的生物学特性。结果获得一个AhHDA1互作蛋白Arachis hypogaea L.Golden 2-like(AhGLK);体外荧光双分子试验证实,AhHDA1与AhGLK蛋白存在相互作用;利用生物信息学软件分析表明,AhGLK含有MYB保守域,其氨基酸序列与大豆(Glyine soja)GsGLK、拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGLK分别具有较高同源性;AhGLK定位在细胞核中并具有转录因子活性,主要在花生的叶片中表达;在30%PEG条件下,AhGLK表达下调。