7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1 like homeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料,分离了多个苹果（Malus domestica）KONX基因,研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明,获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22(GenBank登录号：MG021644～MG021650)。结构域分析表明,获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK结构域。进化分析表明,MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组;MdKNOX10、MdKNOX13、Md...     

茶树脂肪酸去饱和酶家族基因的克隆与表达分析

以茶树品种‘铁观音’为试材,利用RT-PCR技术克隆得到5个脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)家族基因的cDNA序列,分别命名为Cs FAD2-2、CsFAD3、Δ7-CsFAD、Δ8-CsFAD和CsFAB2,其编码序列长度1 137～1 320 bp。系统发育与基序分析结果表明,茶树FAD成员来自4个亚家族,即ω3/ω6-FAD亚家族、Δ7/Δ9-FAD亚家族、FrontendFAD亚家族和FAB亚家族。同一亚家族成员的保守基序一致,而不同亚家族的保守基序存在较大不同。荧光定量PCR结果表明,5个CsFAD家族基因都显著响应低温诱导,Δ8-CsFAD对低温胁迫响应最强烈,表达水平上调千倍;外源ABA处理后,除CsFAD3外,其他4个CsFAD基因的表达均上调2倍以上;干旱胁迫下,5个Cs FAD中CsFAD2-2、Δ7-CsFAD和Δ8-CsFAD表达水平都上调1.5倍以上,其中Δ8-CsFAD的表达上调最大,达5.5倍,而CsFAD3和CsFAB2的表达受到干旱处理抑制显著下调。克隆并分析Δ8-CsFAD启动子,发现存在多种与逆境胁迫响应相关的顺...     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况,以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员,并进一步筛选其互作蛋白,为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础,获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况,应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证,并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因,随机分布于7条染色体上,都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域,均属于碱性不稳定亲水蛋白;聚类分析表明,葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族,其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近,VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明,VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

茶树低温胁迫转录因子CsICE的亚细胞定位及表达分析

 以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用PCR技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子CsICE的开放阅读框,长度783 bp。采用荧光定量PCR分析CsICE的表达量,结果表明CsICE在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的4倍;在500 μmol ? L^-1 ABA处理下,幼叶中CsICE表达峰值是对照的40倍,在4 ℃低温处理下,最高值是对照的20倍,在10%聚乙二醇6000处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的5倍。亚细胞定位结果显示CsICE定位在细胞核上。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY转录因子是植物中所特有的一类转录因子,以基因家族形式存在,并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜CIRKY54基因。序列分析表明,该基因开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD,等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示,该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性,处于同一分支上。亚细胞定位分析显示,该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性,结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达,但是在叶片中表达量最高;H_2O_2可以诱导该基因的表达,而乙烯处理可以抑制该基因的表达,这说明该基因可能参与逆境下H_2O_2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下,该基因表达无变化,说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析

以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用 PCR 技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子 CsICE 的开放阅读框,长度 783 bp。采用荧光定量 PCR 分析 CsICE 的表达量,结果表明 CsICE 在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的 4 倍;在 500 μmol L-1ABA 处理下,幼叶中 CsICE 表达峰值是对照的 40 倍,在 4 ℃低温处理下,最高值是对照的 20 倍,在 10%聚乙二醇 6000 处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的 5 倍。亚细胞定位结果显示 CsICE 定位在细胞核上。     

枣E类MADS基因在花和果中的表达及其蛋白互作研究

以'金丝小枣'花和果实为试材进行E类MADS-box基因的生物信息、表达、亚细胞定位及蛋白互作研究.3个E-type MADS-box基因分别位于SEP1/2、SEP3和SEP4进化支.与其他物种的同源序列相比,E类蛋白在进化中非常保守.3个E类基因在枣的花和果实中均有表达,ZjSEP1/2在花不同发育时期表达比较稳定...     

月季RhNAC31互作蛋白的筛选及分析

为了进一步研究RhNAC31在胁迫响应中的作用机制,以RhNAC31蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统在切花月季‘萨曼莎’失水胁迫cDNA文库中进行了互作蛋白的筛选和分析。根据RhNAC31的转录激活区域(C端,157～286 aa)的序列特征,将其划分为C1(157～250 aa,RhNAC31-C1)和C2(251～286 aa,RhNAC31-C2)两段,分别构建到pGBKT7上检测其自激活活性及对酵母Y2H Gold细胞的毒性。结果显示,pGBKT7-RhNAC31-C1和pGBKT7-RhNAC31-C2对酵母Y2H Gold细胞均没有毒性,能激发金担子素A(Aureobasidin A,AbA)报告基因的表达,具有自激活活性,在含有400 ng·mL-1 Ab A的SD缺陷型培养基上其活性受到抑制,以含该浓度AbA的培养基作为筛选文库培养基。在此筛选条件下,在酵母双杂交文库中筛选到21个阳性克隆,对其测序并用Blast比对获得了16个与RhNAC31互作的候选蛋白。利用Uniprot网站对互作蛋白进行基因本体学分析,结果显示RhNAC31能够与RZFP34、MIEL1、RUB泛...     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

节瓜CqWRKY31的互作蛋白筛选与鉴定

枯萎病是节瓜生产中的主要病害,节瓜抗性材料中CqWRKY31受致萎毒素镰刀菌酸(FA)胁迫诱导表达,为节瓜响应FA胁迫的正调控因子.为深入挖掘CqWRKY31的功能,本试验利用酵母双杂交技术筛选CqWRKY31的互作蛋白.试验结果显示,共得到45个与节瓜CqWRKY31有潜在互作关系的蛋白.通过进一步回转验证,发现42...     

茶树CsAIL的克隆及在不同休眠阶段的表达分析

从茶树不同休眠状态腋芽转录组中筛选出一条差异表达基因,经全长克隆和同源性分析证实该基因为与多年生植物休眠的形成和解除密切相关的AINTEGUMEN-LIKE(AIL)的同源基因,命名为CsAIL。生物信息分析表明,该基因包含1个1 872 bp的开放阅读框,编码623个氨基酸。编码的蛋白质分子质量为69.2kD,理论等电点为6.6,是一种非分泌性蛋白;该蛋白有两个保守的AP2结构域,是植物中特有的广泛参与生长发育调节的AP2亚家族成员。亚细胞定位预测CsAIL蛋白不存在于叶绿体或者线粒体中,可能定位于其他细胞器;经同源性分析,在‘云抗十号’和‘舒茶早’全基因水平上分别鉴定了11个和12个AIL同源基因。系统进化树及序列保守性分析显示,Cs AIL与‘云抗十号’CSA001743.1和‘舒茶早’TEA027750.1的进化关系最近,与已知的拟南芥AIL蛋白处于不同分支,但具有典型的保守结构域和已知的重要氨基酸位点。启动子序列分析显示该基因可能受生理节律、光及多种激素等信号共同调控。CsAIL在茶树顶芽、腋芽和茎中的表达量较高,叶片中较低,花中几乎不表达。在茶树冬季类休眠和生理休眠阶段,该基因的表达量在叶和越冬芽中均逐渐下调并维持在较低水平;在生态休眠及萌动阶段显著上调。分析其可能的下游调控基因CsCYCD3.2和CsCYCD6.1的表达,二者与Cs AIL的表达模式高度一致,与越冬芽的休眠状态存在高度关联。本研究表明,CsAIL可能是参与茶树休眠调控的关键基因,与CsCYCDs共同在茶树年休眠—生长循环中发挥作用。     

金线莲ArLBD1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)叶片的转录组数据为基础,采用RT-PCR技术克隆到了金线莲ArLBD1转录因子基因,采用生物信息学、原核表达、Western blot、亚细胞定位及qPCR等方法对该基因功能进行初步分析,以期为进一步研究其功能提供参考依据。结果表明：ArLBD1基因CDS长度864 bp,编码287个氨基酸。ArLBD1蛋白分子量为30.62 kD,理论等电点为6.25,不稳定系数55.55,属于不稳定蛋白。ArLBD1蛋白含有LOB superfamily保守结构域,第7～28氨基酸为C基序,第36～84氨基酸为GAS基序,第89～107氨基酸为类亮氨酸拉链基序,具有完整的类亮氨酸拉链基序,属于ClassⅠ。系统进化分析表明ArLBD1与拟南芥AtLBD36的亲缘关系最近,其次是AtLBD6。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,ArLBD1基因在大肠杆菌中成功诱导表达。亚细胞定位分析发现ArLBD1蛋白定位在细胞核。qPCR分析结果表明,ArLBD1基因在金线莲叶、茎和根中都能检测到表达,在叶片表达量最高,其次是根,茎的...     

茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的cDNA为模板,利用RT?PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因（CsNiR）,得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 kD,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,CsNiR具有完整的NiR 蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1和0.1 mmol · L^-1 NH₄NO₃）,qRT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究CsNiR基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。     

柑橘黄龙病菌亚洲种、虫媒及植物寄主互作研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)病原入侵寄主植物后不仅会对其代谢、激素调节、防卫反应等方面产生影响,同时,木虱获菌后,其发育、倾向性及内共生菌种群也会发生改变,病原还能通过改变寄主植物的挥发性信息物质等间接调控媒介昆虫行为。对黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)、虫媒及植物寄主互作相关研究进行综述,并对今后相关研究进行了展望,以期对柑橘黄龙病研究有所促进。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

茶树CsTIFY家族全基因组鉴定及非生物胁迫和激素处理中主要基因表达分析

TIFY转录因子是陆地植物特有的转录因子,按照结构域特征共分为4个亚家族TIFY、PPD、JAZ、ZML,调控植物的生长发育过程.以茶树TIFY转录因子为研究对象,从茶树基因组数据库中共鉴定了22个CsTIFY转录因子家族成员,都包含了TIFY结构域.基因结构分析发现,大部分CsTIFY家族成员外显子数在5到12之间,...     

基于全基因组的茶树PAL家族基因鉴定及其在生物与非生物胁迫下的表达分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)在植物物质代谢和抗逆过程中发挥重要作用。利用生物信息技术在茶树阿萨姆变种‘云抗10号’和茶变种‘龙井43’基因组中分别预测获得5条和6条PAL家族基因。系统发育树显示,拟南芥、杨树和茶树PAL亲缘关系较远,茶树阿萨姆变种和茶变种存在进化差异。对茶树转录组数据分析发现:盐胁迫和茉莉酸甲酯处理可显著诱导PAL家族基因表达,其对冷胁迫和干旱胁迫响应不显著,在茶树老叶中的表达较低,而在幼嫩组织和根中的表达均较高,其中PALa、PALc、PALe在花中表达最高。q RT-PCR结果表明,茶树炭疽菌(Colletotrichum camelliae)、拟盘多毛孢菌(Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis)和茶尺蠖(Ectropis oblique)接种处理茶变种‘龙井43’和新品系‘2807’24 h后,6个PAL家族基因均显著上调表达。以上结果表明,茶树PAL家族基因在应对不同逆境胁迫时发挥重要功能。