草鱼醛缩酶A3'-UTR突变与生长性状相关研究

采用直接测序法筛选草鱼(Ctenopharyngodon idella)醛缩酶A 3'-UTR突变位点,发现其转录终止密码子后58 bp处存在17 bp的插入片段。对草鱼养殖群体的插入突变进行分型,检测到该群体有AA、BB、AB三种基因型,等位基因B在群体中的频率为0.723,处于Hardy-weinberg平衡,多态信息含量是0.32,此突变在所测群体中属于中等遗传变异。利用一般线性模型分析基因型与草鱼群体生长性状(体重、体长、体高、体宽)的相关性,结果表明:醛缩酶A 3'-UTR突变与草鱼体宽和吻长2个生长性状达到显著相关(P<0.05),BB基因型个体比AA基因型个体的体重增加8.37%,在全长、体长、体高、尾柄长等生长性状也表现出比AA和AB基因型个体好。可将醛缩酶A 3'-UTR上的这段插入突变位点作为草鱼生长性状的候选分子标记用于草鱼的选育。     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

草鱼7个插入/缺失型突变多态性及与幼鱼生长性状关联分析

对草鱼生长性状进行数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)定位过程中,在15号连锁群中定位到一个与体质量相关的QTL,本研究根据已有的草鱼遗传连锁图谱和基因组序列,拟用短片段重复序列(short tandem repeat,STR)分型技术对该连锁群的3个scaffolds中插入/缺失型突变位点进行筛选,以降低分型成本,同时将筛选出的7个多态性位点与草鱼幼鱼生长性状进行关联分析。结果显示,(1)草鱼3个scaffolds中44个插入/缺失型突变位点中有17个简单重复序列(又称微卫星,simple sequence repeats,SSRs),2个位点引物设计不成功,设计的25对引物中仅22对扩增和分型成功;(2) 22个位点中仅有7对引物在4个亲本中存在多态性,直接测序结果发现,STR分型技术不仅可准确对插入/缺失型突变位点进行分型,同时可降低分型成本;(3)将7个插入/缺失型突变位点与323尾选育F2草鱼的生长性状进行关联分析发现,除了位点ID-10H和ID-41F以外,其余5个位点都与草鱼幼鱼的一个或多个生长性状显著相关,其中ID-6H与幼鱼肥满度性状显著相关,位点ID-11F、ID-15F、ID-32F和ID-39F分别与草鱼幼鱼体质量、体长、体宽和体高性状显著相关,可将以上5个与草鱼幼鱼生长性状相关的突变位点用于草鱼生长性状QTL加密和分子标记辅助育种。     

刀鲚内皮素1基因SNP多态性及其与颌骨性状相关联分析

为探究刀鲚(Coilia nasus)内皮素1 (endothelin 1, Edn1)基因对刀鲚上颌骨长度的影响,根据此前的基因组重测序结果以及刀鲚基因组数据库,通过PCR扩增得到刀鲚Edn1基因序列,并使用直接测序法筛选并分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,分析各位点的基因型,并计算各位点的基本遗传参数、基因型频率和基因频率,将筛选出的SNP位点与刀鲚上颌骨长度性状进行关联分析、连锁不平衡分析和双倍型分析。结果表明,在刀鲚Edn1基因中共挖掘出5个SNP位点,分别为T134C、A418C、G1322A、C1607T、A1636C。G1322A与A1636C两个位点之间处于连锁不平衡状态。关联分析结果显示, T134C位点和A418C位点与上颌骨长度性状之间存在显著相关性;双倍型分析结果显示,T134C位点和A418C位点组成的双倍型中,D3(杂合TC和纯合AA)的上颌骨长度显著长于D1(纯合TT和杂合AC)和D2(纯合TT和纯合CC)。此外,刀鲚开口高度/头长和上颌骨长/头长的皮尔逊相关系数r=0.41,属中等正相关。研...     

大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8 box和Octamer(＋)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P＜0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。     

草鱼D-loop多态性与幼苗生长性状的关联分析

为了探索草鱼(Ctenopharyngodon idella)线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)多态性对生长性状的影响,鉴于mt DNA的母性遗传特征,本研究基于2011年繁殖用的20尾母本的D-loop序列信息,与通过亲子鉴定获得的853尾40日龄子代的体长、体质量进行关联分析。结果显示,草鱼6种D-loop单倍型对生长性状表型差异具有极显著影响(P0.01);其中,单倍型为Hap16的子代的体长最大,并显著大于单倍型为Hap4的子代的体长(P0.05);单倍型为Hap18和Hap16的子代的体质量较大,依次大于其他单倍型子代的体质量,并显著大于单倍型为Hap4的子代的体质量(P0.05)。此外,草鱼D-loop序列各变异位点基因型对生长性状的影响水平不同;其中,Site01、Site06和Site07等3个位点对体长的差异存在显著影响(P0.05),Site06和Site07等2个位点对体质量的差异存在显著影响(P0.05)。研究表明,草鱼D-loop序列变异对子代生长性状具有显著影响,推测在草鱼生长性状改良的选育进程中,可以利用mt DNA多态性信息进行辅助选择。     

草鱼EST-SSRs标记的筛选及其与生长性状相关分析

利用草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST(expressed sequence tags)数据库开发的18个EST-SSR标记,对草鱼群体进行基因型与生长性状关联分析和群体遗传多样性分析,结果表明:关联分析得到6个微卫星位点(13118、13305、24017、25085、35939和40698)与体重,体长和体高显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01)。对其进行多重比较获得有利基因型分别为13118位点的BB、13305位点的AD、24017位点的AC、25085位点的BE、35939位点的BB和40698位点的BB。将6个微卫星位点上的EST序列与GenBank数据库进行BLAST比对,其中24017序列与鲤鱼自然杀伤细胞增强因子(NCEF)同源性水平高达86%,25085序列与草鱼反应元件结合蛋白(CREB)的基因同源性水平达到80%。应用这18个微卫星位点对草鱼养殖群体进行遗传多样性分析,共检测到82个等位基因,平均等位基因4.556个,每个位点检测到的等位基因数为2～9个,群体的平均观测杂合度为0.452 9,平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.457 1和0.401 7,表明该群体遗传多样性处于低水平。     

草鱼PRL基因多态性与幼鱼生长性状和肌肉成分的关联分析

为了探索草鱼(Ctenopharyngodon idella)PRL(prolactin)基因多态性与草鱼生长性状和肌肉成分的关联性,通过测序法从10尾草鱼的PRL基因中筛选到6个突变率高于30%的变异位点,包括5个单核苷酸变异位点和1个插入型突变(–/CACTCACTA),分别命名为2551GA、2639GC、3247AG、5197TG、5897GA和3391–+。利用AS-PCR(allele-specific PCR)和基因分型技术对192尾4月龄草鱼的PRL基因变异位点进行检测;基于一般线性模型对变异位点多态性与草鱼生长性状和肌肉成分进行相关性分析。研究发现,2639GC、3391–+和5197TG对体长和体重具有显著影响(P0.05),2639GC对肌肉粗蛋白含量具有显著影响(P0.05)。单个位点基因型比较发现,3391–+的突变型(–+和++)个体的体长和体重均显著高于野生型(––)个体(P0.05);2639GC的GC及5197TG的突变型(TG和GG)个体的体长和体重分别显著低于2639GC的GG和5197TG的TT野生型(P0.05);2639GC突变型(CC)个体的粗蛋白含量显著高于2639GC其他基因型(GG和GC)个体(P0.05)。两位点组合比较发现,含3391–+突变型(–+和++)的组合对应体长和体重普遍高于其他组,含2639GC的CC突变型的组合对应粗脂肪含量和粗蛋白含量普遍较高,其中粗蛋白含量显著高于其他组(P0.05)。研究表明,草鱼PRL基因多态性与草鱼生长性状和肌肉成分间存在显著关联,推测相关变异位点可作为草鱼生长和肉质改良的候选辅助标记。     

草鱼MSTN-1基因多态性及与早期生长性状和肌肉成分关联分析

为研究草鱼MSTN-1基因多态性及与早期生长性状和肌肉成分的相关性,本研究扩增出全长为3824 bp的草鱼MSTN-1基因,用长江选育草鱼群体对MSTN-1基因多态性进行筛选和验证。结果共发现3个多态性位点(Locus 1:C1799T,野生型EE/突变型EF;Locus2:C1842T,野生型HH/突变型HI;Locus 3:TGAAGCGCTGGTTCT/2585-,野生型BB/缺失型BD)。利用一般线性模型分析3个位点及其组合型(剔除个体数少于3的组合)与生长性状和肌肉成分的相关性,发现2个位点对幼鱼生长性状表型差异有显著影响,但3个位点对肌肉成分差异均无显著影响。多重比较发现,单倍型HI突变组的体长和体质量显著高于HH野生组,BD突变组的体长和体质量显著性低于BB野生组;多倍型中存在HI突变组合的体长、体质量均显著高于其他组,存在BD突变的组合在体长性状方面显著低于其他组。表明草鱼MSTN-1基因3个SNPs中,HI突变是对草鱼生长性状的有利突变,BD突变是不利突变,而EF突变无显著影响,可将MSTN-1基因作为分子标记辅助草鱼选育的候选基因。     

草鱼GH基因3'部分序列多态性与生长性状及肌肉成分的相关性分析

为了解草鱼GH基因多态性与早期生长性状及肌肉成分的相关性,实验利用直接测序法从156尾草鱼GH基因的3′部分序列中共筛选到9个变异位点(分别命名为SNP1~SNP9:G2825A、G2914T、T2966G、A3002T、T3022C、A3301G、C3463T、C3547T、C3620T)。卡方检验结果显示,9个位点均未显著偏离Hardy-Weinberg平衡,且均表现为中等多态性(0.25PIC0.5);经连锁不平衡分析发现,SNP3、SNP4和SNP5位点为一组完美连锁不平衡,SNP2、SNP7、SNP9位点为一组完美连锁不平衡;GH基因3′部分序列5个位点单倍型分析共发现6种单倍型,其中Hap1(30.4%)所占的比例最高,Hap6(4.8%)所占比例最低。利用GLM及多重比较对草鱼GH基因中9个SNPs多态性与早期生长性状和肌肉成分进行相关性分析,发现SNP2和SNP3位点的纯合突变型在体质量、体长和粗脂肪性状上均显著高于野生型和杂合突变型;在双倍型分析时得出了相似的结果,同时含有SNP2和SNP3位点纯合突变的双倍型组合在生长和粗脂肪性状上均显著性高于其他组合。研究表明,草鱼GH基因中SNP2和SNP3位点与早期生长性状及肌肉成分存在显著性相关,可作为草鱼生长及肉质改良的候选辅助分子标记,并且为进一步对相关变异位点的功能验证奠定研究基础。     

草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能

以草鱼鱼鳞为原料, 分别提取鱼鳞中的酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC), 着重开展了其包括热稳定性、体外酶降解性以及胶原海绵材料特性在内的相关研究, 并与哺乳动物来源的猪皮胶原(PC)相比较。实验结果表明, 制备所得的3种胶原蛋白均为典型的Ⅰ型胶原并具有完整的三螺旋结构; PC的热变性温度(41.6 ℃)明显高于ASC(34.8 ℃)和PSC(35.2 ℃); 3种胶原蛋白的体外酶降解性能受水解酶的种类、胶原蛋白提取方法、胶原蛋白来源、胶原蛋白受热历史以及蛋白的自组装程度影响。胶原蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对淡水鱼胶原均具有不同程度的降解能力, 但胶原蛋白酶的降解能力最强; 相同条件下, 3种胶原蛋白体外酶降解率依次为ASC>PSC>PC; 经热变性处理后胶原蛋白的体外酶降解率明显提高而经体外自组装处理后其体外酶降解率均出现不同程度的降低; 3种胶原样品冻干后得到的胶原海绵材料具有不同的机械性能和组织结构, ASC和PSC海绵是一种多孔但拉伸承受力较弱的海绵材料, 而PC则与之相反。     

不同月份养殖草鱼幼鱼消化道微生物群落动态变化研究

为了评估草鱼消化道微生物群落结构在草鱼食性转化后的变动情况,实验对食性转换完成后的草鱼消化道微生物群落结构进行了PCR-DGGE分析。结果显示,不同月份采集草鱼消化道微生物群落结构存在明显差异(Monte Carlo检验,A:F=3.41,P=0.002;B:F=3.58,P=0.002),而被广泛认为影响宿主消化道微生物群落结构的宿主大小、丰满度等因素则在短期内并没有发现会对草鱼消化道微生物群落结构产生影响。实验表明,短期内环境因素可能是造成草鱼消化道微生物群落结构变动的主要因素。本实验结果将为深入阐述草鱼消化道微生物群落结构的变化规律、消化道益生菌的作用机理、消化道微生物群落结构变动与草鱼疾病的关系等问题积累基础材料。     

不同温度对草鱼C、N、P营养要素收支的影响

模拟草鱼养殖周期内的温度波动范围,研究了温度变化对草鱼C、N、P营养要素收支的影响。实验采用4个温度条件(15、18、24和30 ℃)培养草鱼,测定了不同温 度处理组内草鱼C、N、P营养要素的收支情况。结果表明:温度对草鱼C、N、P营养要素收支具有显著影响。15 ℃处理组中,草鱼摄食率、排氨率、排磷率和排粪 率分别为3.405 7、7.533 4、0.000 8和0.601 3 mg/h,显著低于其他处理组,在24 ℃处理组中,达到最大值,分别为10.442 0、18.995 6、0.001 7和 1.647 0 mg/h。草鱼的耗氧率随温度的升高而增加,耗氧率和温度之间变化规律符合方程OR=0.005 9×T^1.2532(R²=0.84)。15 ℃处 理组中,C、N、P营养要素的生长余力分别为1.064 9、0.126 4和0.018 8 mg/h,显著低于其他处理组,在24 ℃处理组中,达到最大值,分别为3.402 8、0.397 1和 0.071 8 mg/h。15 ℃处理组中,C、N、P营养要素的吸收效率分别为81.38%、83.05%和80.30%,显著低于24和30 ℃处理组。     

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼的免疫促进作用

将柱状黄杆菌胞外多糖（EPS）溶液经腹腔注射免疫草鱼，以注射灭菌生理盐水作对照。免疫一周后，分别提取受免鱼与对照鱼肝脏、脾脏、体肾和头肾4种组织中的总RNA，并通过RTPCR半定量的方法检测不同组织中C反应蛋白（CRP）、白介素1（IL-1）、主要组织 相容性复合体I（MHC-I）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素（IFN）等5种免疫基因的表达情况。结果显示，CRP在受免鱼肝脏中的表达显著上升；MHC I在受免鱼脾脏、体肾中的表达显著下降；IgM在受免鱼4种组织中的表达皆显著上升；IL-1在受免鱼4种组织中的表达与对照组没有显著差异；无论受免组还是对照组都只能检测到微弱的IFN表达，且两组之间没有显著差异。结果表明，柱状黄杆菌EPS对草鱼的先天免疫能力以及特异性体液免疫能力具有促进作用。     

草鱼体脂性状的变异特征及相关性

为探究草鱼体脂性状的变异特征及相关性,采用数理统计方法对296尾17月龄草鱼的15个数量性状指标进行综合分析评价。结果显示,草鱼体脂性状(腹脂指数IPF、肝胰脏粗脂肪含量HLC、肌肉粗脂肪含量MLC)具有丰富的变异特征,变异系数范围为21.30%～47.04%。相关分析发现,草鱼3个体脂性状之间呈现显著正相关,表明草鱼脂质沉积在不同组织中具有一定的同步性。进一步的因子与聚类分析显示,观测的15个草鱼数量性状大致分为4类,包括体型因子、体尺因子、脏器指数因子和体脂含量因子,其中IPF归属于脏器指数因子,HLC和MLC二者组成体脂含量因子。多元统计分析发现,草鱼形态性状对3个体脂性状变异的解释量范围为7.45%～24.83%,相较而言,矢状面体型SS可在一定程度上预测体脂性状。研究表明,草鱼体脂性状具备较大的选育潜力,其中IPF整体显示出较好的关联性,可作为代表性目标性状用于育种实践。本研究为草鱼体脂性状选择育种提供了重要参考依据。     

草鱼养殖水体中参与氮转化途径的异养菌分析

为分析草鱼池塘中参与氮代谢的异养细菌比例及其代谢途径,从杭州郊区取得4个草鱼池塘的水样,每个水样通过涂布随即挑选100株菌株进行定性显色试验,并据此选取11株异养菌进行16S rRNA序列分析。结果表明,4个草鱼养殖池塘中NH4+-N和NO2--N的平均水平分别为5.597 mg/L和0.135 mg/L。池塘中可培养的异养菌平均为3.26×105cfu/mL,其中的89.75%参与了氮的不同代谢途径,其中31.25%的氨化菌和33.50%NO3--N(NO2--N)还原菌参与了NH4+-N的生成,32.45%的氨氧化菌参与了NH4+-N的降低;NO2--N生成途径主要包括蛋白质直接转化(11.26%)、氨氧化(4.25%)和硝酸盐氮还原(10.75%),而NO2--N降低主要通过15.50%的亚硝酸氧化菌、8.75%的NO2--N还原菌和10.75%的反硝化菌实现。结果提示,草鱼养殖水体中存在大量的异养硝化菌参与不同的氮代谢途径,且产生氨氮的异养菌比例远高于去除氨氮的菌,这是草鱼养殖水体中氨氮含量易偏高的原因。同时,11株不同功能的异养菌16SrRNA鉴定结果为寡养食单胞菌(Stenotrophomonas)6株、假单胞菌(Pseudomonas)3株、克雷伯氏菌(Klebsiella)和肠杆菌(Enterobacter)各1株,而且细菌对氮源的利用具有菌株特异性。     

草鱼血红蛋白通过诱导头肾巨噬细胞表达的炎症因子激活免疫反应

为了探究鱼类体内过量游离血红蛋白对鱼体的影响,本实验以草鱼为研究对象,通过体内注射血红蛋白模拟体内出血,探究血红蛋白对组织和组织中巨噬细胞的免疫调控作用。体内注射血红蛋白的实验结果显示,血红蛋白的刺激导致头肾和中肾组织中出现明显的血红蛋白沉淀,同时提高了鱼体血清中的抗氧化相关酶活性,促进了头肾组织中炎症因子基因TNF-α、IL-1β和IL-10的mRNA表达水平。普鲁士蓝和间接免疫荧光实验结果显示,头肾巨噬细胞对血红蛋白表现出了吞噬活性。荧光定量PCR检测结果显示,血红蛋白的刺激显著激活了头肾巨噬细胞中CD68、CD86、CSF和MHC-Ⅱ的mRNA表达水平。进一步的细胞因子检测结果显示,血红蛋白刺激12 h后,头肾巨噬细胞中的炎症因子基因(TNF-α、IL-1β和IL-4)、趋化因子基因(CCL20和CCL4)、IFN-α和TLR4的mRNA表达水平被显著上调表达。研究表明,草鱼头肾巨噬细胞对血红蛋白具有吞噬能力,同时血红蛋白也激活了巨噬细胞中多种细胞因子的表达。本研究结果首次阐述了草鱼血红蛋白与巨噬细胞的相互作用关系,丰富了鱼类血液基础免疫学理论,同时也为鱼类健康养殖提供了新的参考...     

草鱼快速启动过程的加速—滑行游泳行为

以3种不同体长的草鱼为研究对象,在水温(20.00±1.50)℃条件下通过惊吓的方式进行了快速启动过程的加速—滑行游泳行为观察,测定了草鱼的疾冲速度,即实验鱼突然加速达到的最大速度。结果发现,体长为(8.47±0.73)cm(稚鱼)、(17.93±1.27)cm(幼鱼)、(51.24±3.24)cm(亚成鱼)的绝对最大疾冲速度及达到最大疾冲速度所需时间分别为(1.449±0.424)m/s(0.294 s)、(2.359±0.434)m/s(0.294 s)、(2.899±0.457)m/s(0.378 s);相对最大疾冲速度分别为(17.099±5.009)BL/s、(13.156±2.418)BL/s、(5.659±0.891)BL/s;实验鱼达到最大疾冲速度后,均以身体保持直线的方式滑行减速。草鱼的绝对疾冲最大速度随体长的增加而增加;相对疾冲最大速度随体长的增加而减小,且稚鱼的相对疾冲最大速度显著高于亚成体。3种实验鱼的绝对游泳加速度间不存在显著性差异,亚成鱼绝对减速滑行加速度的值显著高于幼鱼和稚鱼,而亚成鱼的相对疾冲游泳加速度和相对减速滑行加速度的值显著小于稚鱼。