马尾松纤维素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析

植物纤维素合成酶(Ces A)是林木中纤维素合成过程中的重要酶,与木材形成密切相关。本研究以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的c DNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松Ces A1基因的全长c DNA序列,命名为Pm Ces A1。序列长度为3 142 bp,包含有一个长为2 955 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码984个氨基酸。序列分析表明:Pm Ces A1序列与已报道的火炬松(Pinus taeda)Ces A1基因(AY789650.1)的相似性达99%。对Pm Ces A1所编码蛋白的氨基酸序列聚类分析,结果显示马尾松与松科植物具有较近的亲缘关系。采用实时定量PCR测定了Pm Ces A1在马尾松的嫩枝、叶和根中的表达量,发现以嫩枝中的表达量最高(2.53)。本研究获得的全长基因可以用来构建正义表达载体,再通过遗传转化得到转基因植株,可进一步分析该基因在植株内的表达情况和作用机制,为马尾松纤维素合酶的研究和获得高纤维得率的马尾松良种提供帮助。     

中国水仙凝集素基因的克隆及性质预测

为了探索植物凝集素在分子水平的作用机理,利用RT-PCR技术从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)金盏银台中克隆到一个新的编码凝集素的基因.序列分析与预测结果表明,该基因cDNA片段总长为609 bp,含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽和一个519 bp的完整开放阅读框;编码172个氨基酸,分子量为18 712.31 Da;前体蛋白在氨基酸水平上与杂种多花水仙凝集素、雪花莲凝集素、石蒜凝集素的一致性分别为83%,81%和77%;其二级结构以α-螺旋、不规则盘绕和延伸链为主;三级结构与雪花莲凝集素极其相似,是一种能与D-甘露糖特异性结合的B型凝集素.     

马尾松RCA基因的克隆和序列分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubis CO)活化酶(RCA)是体内活化光合作用限速酶—Rubis CO的重要酶。本研究通过反转录PCR和c DNA末端快速扩增技术,从马尾松中分离得到了Pmrca1(登录号KF420118)和Pmrca2(登录号KF420119)两条RCA基因c DNA序列。两条序列均包含完整的编码区与5'端和3'非翻译区,长度分别为1 816 bp和1 953 bp,编码Pm RCA1和Pm RCA2两个蛋白,长度分别为480和440个氨基酸。序列分析发现两个蛋白质都具有RCA和AAA+蛋白家族(ATPase associated with various cellular activities)特异性结构域和定位于叶绿体的转运肽,Pm RCA1还具有RCA大同工型特有的由两个半胱氨酸(Cys)残基组成的保守结构。多重序列比对显示,这两个蛋白质序列分别与红花槭的RCA大同工型和小同工型的相似性达到78%。将Pm RCA1和Pm RCA2与20种不同物种RCA构建进化树,发现其与地中海松属于同一分支。研究结果为进一步分析马尾松RCA的功能和光合作用机制奠定了基础。     

马尾松幼苗PmMADS4基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因编码的转录因子,在植物、动物及微生物的发育过程中起着重要调控作用,本研究从马尾松幼苗转录组测序结果中筛选到1条具有完整开放阅读框的MADS-box基因序列,设计特异性引物并克隆获得该基因,通过生物信息学方法分析该基因的序列特征、编码蛋白的理化特性、结构域以及进化关系等,并应用荧光定量PCR技术分析该基因在马尾松幼苗不同组织中的表达活性。结果表明,克隆得到的MADS-box基因开放阅读框为672 bp,命名为Pm MADS4。Pm MADS4编码223个氨基酸,含有MADS保守域和K-box次级保守域。蛋白质理论分子量为24854.15 kD,理论等电点为7.83;其蛋白质结构主要由大量的α-螺旋(58.74%)和大量随机卷曲(31.84%)构成;亚细胞预测该基因主要在细胞核(43.5%)、线粒体(17.4%)、高尔基体(13.0%)和细胞质(13.0%)中发挥生物学作用。系统进化分析显示,Pm MADS4属于MADS-box家族基因中MIKC型的GMADS分支。组织特异性表达分析发现,Pm MADS4在马尾松幼苗的顶芽和茎中高表达,表达量分别是根部的239倍和123倍;在根部、初生叶和针叶中的表达量相对较低,表明Pm MADS4可能广泛参与马尾松幼苗地上部分分生组织的发育过程。本研究结果为Pm MADS4基因在马尾松幼苗生长发育调控方面的深入研究提供了数据基础。     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

CD147基因在家兔肠道的克隆与结构预测

基于电子延伸序列,克隆并分析兔CD147基因.采用兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR反应,测序并进行结构预测.克隆的兔CD147基因包含一个完整的开放阅读框架,全长为810 bp,编码由270个氨基酸残基组成的CD147前体蛋白,推导的氨基酸序列信号肽为1～16个氨基酸.氨基酸序列与牛、人、褐鼠、野猪的同源性分别为62.5%,65.9%,59.5%和66.3%,三级结构预测表明CD147具有2个免疫球蛋白类似区.试验成功克隆了兔CD147基因,注册到GenBank(Accession.EU650668),并预测其三级结构,为进一步研究其生物学功能奠定基础.     

大豆KCS基因的克隆及结构预测

以大豆叶片总RNA为模板,利用RT-PCR方法,克隆获得大豆KCS基因序列。采用生物信息学方法对其进行预测分析,结果表明:大豆KCS基因的CDS序列长度为1533bp,编码510个氨基酸;大豆KCS基因编码的蛋白质理论分子量为57.1kD,等电点为9.03;该基因编码的蛋白具有两个完全跨膜结构;没有信号肽;其蛋白质二级结构中α螺旋占47.65%,无规则卷曲占35.88%,β折叠占16.47%;在进化关系上,与油茶、菟葵、苜蓿的亲缘关系相对较近,该研究结果可为大豆KCS基因结构和功能的进一步研究提供理论参考。     

野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析

根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列(AY 888037)设计了PCR扩增引物,以野芥总DNA为模板进行扩增得到了特异扩增条带.测序结果表明,该片段长1 651 bp,序列分析表明其氨基酸编码区为55～1 575 bp,不含内含子序列,共编码506个氨基酸.该基因序列已提交GenBank,登录号为FJ870905.BLASTn分析结果表明,野芥中fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性为76%～98%;BLASTp分析结果表明,野芥中的FAE1与油菜中FAE1存在32个位点差异,其中部分差异可能导致了芥酸含量的不同.     

鸡集落刺激因子(CSF)基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中报道的红原锦鸡集落刺激因子(Colony-stimulating factor,CSF)cDNA序列,利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物,对本地肉鸡注射100 μg/mL ConA试剂,饲养24 h后,取脾脏提取淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆集落刺激因子(CSF)的cDNA片段.对克隆片段进行测序,并利用DNAstar软件进行不同物种间同源性比较.序列分析表明,CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸,与红原锦鸡的序列比较,其核苷酸的同源性为98.4%,氨基酸的同源性为95.2%,同人、犬、印度野牛、野猪、绵羊和老鼠的CSF序列作比较,其核苷酸的同源性分别为28.7%,29.2%,33.6%,30.8%,29.4%和34.7%,氨基酸的同源性分别为8.3%,9.0%,15.3%,12.4%,11.0%和12.0%.然后利用DNAstar和DNAman软件,对鸡CSF的结构进行预测,结果表明,鸡CSF基因为一结构松散的蛋白分子.鸡的CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性.这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础.     

牡丹PsPIP2基因的克隆及其蛋白结构预测

质膜内在蛋白作为水通道蛋白的一种存在类型,在跨膜水分运输中起着重要作用。本研究以本实验室获得的水通道蛋白基因的EST序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增得到1 174 bp的PsPIP2全长cDNA,其中,包括3'UTR 191 bp,5'UTR 137 bp和846 bp的编码区,共编码281个氨基酸,分子量为29.79 kD。PsPIP2包括8个可能的磷酸化位点,其中7个位于丝氨酸(S),1个位于酪氨酸(Y),推测这些磷酸化修饰位点可能与PsPIP2蛋白通道的开启与闭合相关。二级结构预测显示,PsPIP2含无规卷曲和α-螺旋较多。同源性分析结果表明,PsPIP2与木薯PIP2同源性最高。本研究结果可为研究该基因的生物学功能和牡丹花衰老调控机制提供理论基础。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析

鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关,本研究根据擎天凤梨Ostara早期花器的全长cDNA文库,经大规模随机测序及重叠群（contigs）内EST序列的拼接,获得了擎天凤梨多聚泛素基因全长cDNA序列（GenBank登录号：GQ890686）,序列长1896bp,开放阅读框长1323bp,编码441个蛋白氨基酸残基,蛋白质分子质量为49.3kD,等电点pI为6.59。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α螺旋和β-转角组成;系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10（gi｜23397122｜gb｜AAN31845.1｜）亲缘关系最近;经推断它是由5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

水稻Os NAD-ME1的克隆、预测及逆境下的表达分析

植物中的苹果酸酶能够参与光合作用、呼吸作用和脂类生成等多种重要的代谢途径,而且与植物的逆境防御有着密切的关系.为研究水稻中一个苹果酸酶基因(Os NA D-ME1,Gene ID:4343294)的基本特征及其与逆境间的响应关系,克隆得到该基因的cDNA片段,应用生物信息学对其序列进行分析及预测,并运用Northern...