GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析

为了进一步验证GhWRKY44(登录号:KJ801807)基因在烟草异位表达后的功能,构建了Ca MV35S启动子调控、Nos为终止子的棉花抗枯萎病相关基因(GhWRKY44)的过表达载体;电击法将其导入农杆菌GV3101,菌液PCR筛选鉴定阳性菌株,采用农杆菌介导法转化烟草;T0转化植株经卡那霉素筛选、PCR检测后,随机从转基因T0中选取5株进行RT-PCR检测,均为阳性株,说明GhWRKY44基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44基因的转基因烟草T1株系进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果表明,在正常生长情况下,PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加,枯萎病菌侵染后,在转GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加,明显高于野生型株系,而PR5的表达量则低于野生型株系,说明该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达,但其功能仍需进一步研究。     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

逆境诱导型启动子rd29A诱导ipt基因转化烟草的研究

构建诱导型启动子rd29A驱动下ipt基因表达载体,经农杆菌介导转入烟草,同时构建CaMV35S启动子驱动下的ipt表达载体作为对照,以研究两种启动子诱导下目的基因的表达差异.同时对遗传转化后的外植体进行常温(25℃)和4℃低温诱导处理,比较分析不同温度及处理时间对rd29A-ipt及35S-ipt转化的受体材料的愈伤组织诱导、生长和分化情况的影响,结果表明:rd29A启动子在4℃低温诱导12h时,能够很好的调控ipt基因的表达,使烟草外植体正常分化,获得较高的抗性愈伤诱导率,与转rd29A-ipt植株在常温处理以及对照载体低温和常温三种处理之间差异性显著.35S启动子由于诱导ipt基因过量表达而使植株生长受到抑制.PCR检测结果表明ipt基因和rd29A基因已整合到烟草基因组中.     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究

将已克隆的薄荷（Mentha spicata L.）法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase, fps）的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS＋0.1 mg/L IAA＋1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株（K-4,K-6,K-17,K-19,K-35）,证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株（T₁代）对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。     

转Lchi1烟草T_2代对梨腐烂病菌的抗性研究

获得转化梨几丁质酶基因Lchi1的烟草,检测组成型表达Lchi1基因烟草是否能提高对梨腐烂病菌(Valsa ceratosperma)的抗性,从而初步确定Lchi1基因的功能,为进一步开展梨抗腐烂病分子育种工作提供参考。构建梨几丁质酶基因Lchi1的植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,进而对转化的烟草T2代进行PCR及RT-PCR检测。利用离体叶片接种法,更直观地验证转基因烟草对梨腐烂病菌的抗性。Lchi1基因已经整合到烟草基因组中,并在烟草T2代中有效表达,在接种腐烂病菌后转基因烟草较未转基因烟草的抗腐烂病菌能力明显增强。梨几丁质酶基因Lchi1与腐烂病抗性相关联,可作为今后梨的抗腐烂病分子育种研究重要的基因来源。     

水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究

本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用.     

转细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35增强小麦对纹枯病的抗性

Op IAP(Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的基因,p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的35 k Da蛋白。本研究人工合成了Op IAP和p35基因,构建了同时含有Op IAP和p35表达盒的转双价基因载体p Ubi:p35-RSS1P:Myc-Op IAP,两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin,Ubi)和水稻蔗糖合酶-1启动子(sucrose synthase-1 promoter,RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16,获得双价转基因小麦。对T0~T2代植株,利用PCR、RT-PCR、q RT-PCR及Western blot分析,确认导入的外源Op IAP和p35基因能够在4个转双价基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型R0301和WK207对转双价基因小麦的T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定,结果表明,与受体扬麦16相比,双价转基因小麦的T1、T2代植株对纹枯病的抗性明显提高,说明Op IAP和p35基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。     

转几丁质酶基因烟草酶活性及抗病性研究

采用荧光定量法对转几丁质酶基因烟草T2植株的几丁质酶活性进行了测定，结果表明，转基因烟草株系的几丁质酶活性明显高于未转基因烟草，同时发现，pH对转基因烟草中的几丁质酶活性有一定的影响。对转基因烟草接种烟草炭疽病菌进行抗病性鉴定。     

烟草赤星病对不同部位烟叶产值量的损失研究

在烤烟调制期分下二棚叶、腰叶、上二棚叶及顶叶四个部位,进行赤星病不同危害程度对烟叶产值量的损失研究。结果表明：烤烟受赤星病的危害后,腰叶、顶叶各危害级别间产量损失差异不显著;下二棚叶、上二棚叶当危害达3~4级时烟叶产量出现损失;下二棚叶病害级别与产量损失呈显著负相关;上二棚叶、顶叶病害级别与产量损失呈极显著强负相关。当危害程度达0.5级时,各部位烟叶值量开始下降,并随危害加重,值量损失逐渐增大;顶叶病害级别与值量损失呈显著负相关,下二棚叶、腰叶、上二棚叶病害级别与值量损失呈极显著强负相关。各部位烟叶病害级别与中等烟比例呈极显著强负相关,病害级别与下等烟比例呈极显著强正相关。     

抗烟草丛顶病转基因烟草的培育

烟草丛顶病由烟草丛顶病毒、烟草脉扭病毒、烟草脉扭病毒伴随RNA和烟草丛顶病卫星RNA复合侵染引起的毁灭性病害,为了构建这四种病毒的干扰载体,培育抗病毒烟苗,本研究首先利用PCR扩增、酶切、克隆、连接转化和胶纯化技术分别得到携带酶切序列约200 bp的四种病毒目的片段;其次,用目的片段与携带有对应酶切序列的pENTR?2B入门载体连接、检测和纯化得到携带有目的片段的入门重组载体pENTR?2B-Vims;最后,用入门重组载体与表达载体PK7GW1GW2进行LR反应,经PCR检测得到正确干扰重组载体后,再用叶盘法将目的基因转入烟草叶片中,进一步用组培技术培育组培苗。本研究为解决目前烟草丛顶病防治难题,提供烟草生产发展技术思路和理论依据。     

膜上烟和膜下烟移栽对烤烟生长发育及烟叶品质的影响

为了解决调整生育期是否对烟叶产质量产生影响的问题,以‘K326’为试验材料,采用膜上、膜下移栽的方法对烟叶产质量进行研究。结果表明：膜下烟移栽虽然可以提早移栽期,但是烟叶成熟时间提前却很少,膜下膜上移栽对烟株的生长发育、植物学性状及烤后烟叶的经济效益、烟叶质量等的影响不大,但是膜下烟移栽用工却增加不少,所以还是以3月上旬膜上移栽方式较为适宜。     

外加酶在烟草行业中的应用

酶在烟叶调制、陈化和贮存期间起着非常重要的作用。近年来关于如何利用外加酶改善烟叶内在品质已经成为烟草行业的热点话题。利用酶制剂可以降解烟叶中过量的淀粉、蛋白质、细胞壁物质和果胶质,增加香气和改善质量品质。另外,酶制剂在烟草添加剂、烟草香料、烟草薄片中的应用,酶制剂和微生物配合使用的研究也在增加。     

锌、硼对烟草生长发育及其他矿质元素积累的影响

为探讨微量元素在土壤中的安全范围,采用温室盆栽的方法,研究土壤中锌和硼的有效含量对烟草生长及其他元素积累的影响。结果表明,当土壤有效锌含量达到4.69 mg/kg或有效硼含量达到3.32 mg/kg时,烟株都会表现出中毒症状;土壤有效锌含量较高时,锌向叶片积累,有效硼较高时,硼向茎中积累;硼与铁、镁相互促进,与钙拮抗,锌与铜相互促进,与铁表现出相互抑制。     

烟草番茄斑萎病的研究进展

烟草番茄斑萎病是一类在局部地区产生严重危害的烟草病害,由布尼亚病毒科番茄斑萎病毒属典型成员烟草番茄斑萎病毒系统侵染引起。目前该病在中国许多省均有发生的报道,在云南烟区广泛分布,在局部地区可造成60%以上的严重损失,烟草番茄斑萎病被认为是世界上对烟草最具潜在危险病害之一,较为系统全面的综述了烟草番茄斑萎病的发生与分布,病害症状学,病原物,致病机制,病毒基因组结构和功能以及病害的流行及控制等方面的研究进展。     

马龙和沾益烟区土壤与烟叶铁元素分布特征及其对烟叶感官质量的影响

研究了曲靖烟区马龙和沾益2个县土壤与烟叶中铁元素含量的分布特征及其主要影响因素,分析了烟叶铁含量对烟叶感官质量的影响。结果表明,马龙和沾益植烟土壤有效铁含量较丰富,平均值为66.23mg/kg,变异系数为70.45%,有效铁含量不足区域占比较低,仅为7.17%,地区间差异显著;土壤有效铁含量与pH值间呈极显著负相关,烟叶铁含量与土壤有效铁含量间呈极显著正相关;烟叶铁元素含量对感官质量影响显著,随着烟叶铁元素含量的增加,烟叶香气质、香气量、余味、燃烧性和干燥感呈先升高后降低的变化趋势,烟叶杂气、刺激性、香型、成团性和柔和性呈先降低后升高的变化趋势。     

浅议烟叶的产地效应

通过论述环境与烟叶品质的关系,提出了烟叶产地效应的概念,即烟叶产地环境条件不同,烟叶的外观质量、化学成分和内在质量等方面也存在明显的差异。产地效应受诸多因子影响,重点论述了土壤、降水、温度、光照等因子作用。初步阐述了烟叶产地效应的意义。     

烟草对花叶病毒诱导抗性及其遗传传递效应的研究

采用化学诱导的方法进行烟草对花叶病毒的诱导抗性的试验研究。发现用Ｓ３０和Ｌ１两种诱抗剂均能在烤烟，白肋烟和心叶烟上诱导出对ＴＭＶ的抗性。诱抗效应达１９．１％－３５．６％。此外，诱抗后心叶烟，白肋烟还表现出枯斑反应提前和枯斑缩小等抗性增强反应。将诱抗材料子代接种ＴＭＶ，证明有诱抗性传递现象，其传递效应为２５．２％－４２．６％。经连续三代用Ｌ１诱抗剂在同一烤烟品种（Ｇ１４０）的苗期和花期分别诱导，其子     

木醋液对有机烟草产质量及病害的影响

通过田间小区试验,将木醋液施入植烟土壤和叶面喷施,研究了木醋液对有机烟草产量和品质的影响,探讨木醋液对有机烟草生长及品质改善方面的作用。研究结果表明：施用木醋液增加了有机烟草产量和产值,根施150 kg/hm²和叶面喷施稀释1000倍木醋液处理效果最好,分别使产量增加了32.0%和25.4%,产值增加了52.0%和32.4%。对有机烟草的茎围没有明显影响,但在烟草打顶期可增加烟草的株高和最大叶面积。明显提高了有机烟叶钾含量,叶面喷施稀释1000倍木醋液处理比对照增加了1.44%,并且叶面喷施的效果要优于根施,有机烟叶的有机物质总糖、还原糖、烟碱含量适中,化学成分比例更协调。明显降低了有机烟草普通花叶病和黑胫病的发病率,对烟草白粉病没有影响。