柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用

建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。     

稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用

 根据稻曲病菌核糖体转录间隔区（ITS）序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时PCR定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24 fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae于2007年被列为我国进境植物检疫性有害生物,国内急需建立针对该菌切实可行的检测技术, 以有效控制它在我国的传播。采用实时荧光PCR（real time fluorescence PCR）和经典PCR技术进行水稻细菌性谷枯病菌检测。研究结果表明,供试所有谷枯病菌都能产生139 bp左右的特异性片段,非谷枯菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,常规PCR技术在病菌浓度为104CFU/mL时即可检测到,实时荧光PCR技术在病菌浓度为102CFU/mL时即可检测到,后者比前者的灵敏度高100倍。将模拟带菌种子与灭菌种子按1∶100混合,实时荧光PCR技术可以检测到该菌的存在。     

橡胶树红根病病原菌LAMP检测方法的建立及应用

由灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)引起的红根病是橡胶上危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害.本研究利用环介导等温扩增技术(LAMP),以G.pseudoferreum线粒体Large rDNA特异片段为靶标序列,设计出G.pseudoferreum特异性LAMP引物,以SYBR Gree...     

宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法建立

利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法.实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体上,通过测序和序列比对,除两端引物序列完全相似外,其余部分没有同源性,因此可以作为定量检测的非同源模板.通过计算非同源模板的拷贝数,进行竞争定量PCR检测宿根矮化病,建立宿根矮化病菌的标准竞争曲线和直线回归方程.本研究建立的竞争定量PCR检测方法操作简单、特异性和敏感性高,适合于宿根矮化病菌的检测,并可为其它病菌竞争定量PCR检测方法的建立提供参考.     

水稻干尖线虫的环介导恒温扩增技术(LAMP)快速检测方法

【目的】本研究旨在为水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie,1942)的快速检测鉴定和早期诊断提供一个新的检测方法。【方法】利用水稻干尖线虫18S核糖体RNA基因,设计了水稻干尖线虫LAMP的特异引物,该引物包括1对外引物、1对内引物和1对环引物,以LAMP特异引物对待测样品DNA进行恒温扩增,扩增产物通过电泳法和荧光染料法进行检测,电泳检测出现阶梯状条带或加入荧光染料显现绿色荧光,则证明待检样品中含有水稻干尖线虫。【结果】本方法可以检测鉴定水稻干尖线虫不同虫态(雌虫、雄虫、幼虫或卵)的个体,可以从多种线虫混合的样品和植物组织样品中直接检测出水稻干尖线虫,检测灵敏度达到1/1000条虫DNA。【结论】本检测方法具有准确、灵敏、稳定和结果直观的优点,且操作简便、实用性强。     

进境美国大豆夹杂向日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定

向日葵茎溃疡病菌是我国进境植物检疫性病原真菌。自进境美国大豆夹杂的向日葵种籽上,采用常规平板法分离并纯化获得1株疑似向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi菌株8616S3。形态学特征观察表明,该菌株在PDA上产生大量分生孢子器和β型分生孢子,但未见有性阶段。经rDNA ITS基因序列比对分析,发现该菌株与GenBank中多个向日葵茎溃疡病菌菌株的ITS基因序列同源性达99%以上,位于同一个分支。致病性测定结果表明,该菌株可侵染向日葵茎部,引起典型向日葵茎溃疡病症状。美国是我国主要大豆进口来源国,这是我国首次从进境美国大豆夹杂物中截获向日葵茎溃疡病菌D.helianthi。     

进口大豆中菜豆晕疫病菌巢式PCR检测方法的建立

为实现对进口大豆样品中菜豆晕疫病菌的快速检测,本研究根据菜豆晕疫病菌的argK特异性序列设计引物52B/8F和24B/24F,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。试验结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆晕疫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR检测方法对菜豆晕疫病菌基因组DNA和菌悬液检测时,其灵敏度分别达到0.916×10-4ng/μL和2.4×103CFU/m L,比常规PCR灵敏度高1 000倍。在对100份进口大豆样品检测时,3份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明3份大豆样品中携带的病菌确实为菜豆晕疫病菌。本研究所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

木薯细菌性枯萎病菌hrpG基因突变体的获得

为研究hrpG基因在木薯萎蔫病菌致病机理方面的功能,开展了该基因的插入突变及其与致病性之间关系的初步研究.利用pK 18mob质粒载体构建了敲除载体,采用电击法将该载体转化野生型菌株.获得了该基因的突变体并进行了分子鉴定,同时对菌龄、电压、培养基等参数进行了优化.试验结果表明,该基因控制着病原菌的致病性.     

3种常用杀菌剂对不同来源木薯细菌性萎蔫病菌的毒力测定

细菌性萎蔫病是世界范围内木薯种植中的重要病害,但防控技术研究较少。采用含毒介质法评价了3种常用杀菌剂对不同来源的29个病菌菌株的抑菌作用。结果表明,供试菌株对净刹(80%乙蒜素EC)和农用硫酸链霉素(72%硫酸链霉素SP)敏感性较高,而对可杀得贰仟(53.8%氢氧化铜WG)表现出不同程度的抗性。建议生产中使用乙蒜素和硫酸链霉素对该病进行防治。     

芒果细菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆与序列分析

根据黄单孢菌属LuxR基因的同源性设计简并引物XF/XR,采用同源克隆法从芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)中获得了约1.4 kb的DNA片段。经测序和序列同源性分析表明,该基因片段长1 422 bp含有一个完整的LuxR同源基因,并命名为XcmR。生物信息学分析表明,XcmR基因完整ORF(开放阅读框)全长765 bp,编码254个氨基酸,分子质量和等电点分别约为28.2 ku和8.9,与GenBank中公布的Xanthomonas属LuxR或AhyR/AsaR氨基酸序列具有86%~99%相似性。系统聚类结果表明,XcmR与来源于柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、番茄疮痂病菌(X.c.pv.vesicatoria)、水稻白叶枯菌(X.oryzae pv.oryzae)和甘蓝黑腐病菌(X.c.pv.campestris)的LuxR蛋白聚成一支。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,XcmR是LuxR蛋白家族的一员,具有LuxR蛋白相似结构。     

木薯细菌性萎蔫病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇分子分析

细菌性萎蔫病是世界范围内木薯种植中的重要病害,也是中国木薯种植中为害最严重的病害。前期研究发现铜基杀菌剂对国内木薯细菌性萎蔫病防效欠佳,随即开展了病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇的分子分析工作。评价了42个不同来源病原菌菌株对硫酸铜的抗性,发现其抑菌最低有效浓度均在1.35~1.75 mmol/L之间。通过和已报道黄单胞菌类抗铜相关基因的比对分析,发现来自广西的菌株GX11携带有cop TAB和Xme RSA2个抗铜基因簇。对来自南美州、非洲和亚洲67个菌株的基因组序列分析发现绝大多数菌株均带有这2个基因簇,聚类分析发现相关基因在菌株之间具高度的同源性。     

用单克隆抗体酶联免疫吸附测定法检测水稻种子上的白叶枯病菌

我们于1988年建立了以水稻白叶枯病菌单克隆抗体为第二抗体的酶联免疫吸附测定法,虽然具有灵敏、精确、简便、快速的优点,但用于检测水稻白叶枯病病种所带的微量细菌,灵敏度仍然不足,存在漏检现象。因而,我们对利用单克隆抗体检测水稻白叶枯病病种的方法作了进一步的改进研究。     

Effect of microwave radiation on dry bean seed infected with Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli with and without the use of chemical seed treatment

Common bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) is a seed-borne disease that is difficult to control in dry bean (Phaseolus vulgaris L.). Laboratory and field studies were conducted over a two-year period to determine the effect of microwave radiation on navy (cv. Navigator and Envoy) and pinto (cv. AC Ole) bean. Laboratory tests resulted in a 12 to 25% decrease in germination following 50–60 s of radiation, while less than a 10% loss was observed between 0 and 40 s. Pathogen viability was also tested, however the incidence of pathogen infection was low and no correlation was observed between exposure time and the incidence of colonization. In field studies conducted at Morden, MB (2012) and Ridgetown and Exeter, ON (2012–2013) microwave radiation and two chemical seed treatments (copper hydroxide 53.8% and pyraclostrobin + fluxapyroxad + metalaxyl) were evaluated for their effect on emergence, disease infection, seed pick, yield and return on investment. The application of microwave treatment decreased emergence by up to 7%, but did not impact the other parameters measured. Chemical treatment alone or in combination with microwave treatment also did not affect emergence, disease incidence, yield, seed pick, or return on investment.