农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究

以大豆品种"中豆32、Peking、早熟18、绥农14"子叶节为受体材料,用农杆菌介导法转入与抗逆相关的小麦Na /H 逆向转运蛋白基因(TaNHX2),探索外植体大小、培养基主要成分、培养时间等因素对外植体分化的影响,旨在优化遗传转化条件,提高大豆转基因的遗传转化效率.研究结果表明,以健康外植体获得率、抗性丛生芽获得率和抗性芽伸长比率为指标,筛选并建立的优化转化系统为:大豆萌发和不定芽诱导时分别加入0.5 mg L-16-BA和1.0 mg L-16-BA,浸染时间为30 min、共培养时间为3 d;外植体大小为2/3子叶,kan抗性筛选浓度第一阶段和第二阶段分别是60和50 mg L-1;利用上述方法,已获得中豆32转基因再生植株,经PCR分子检测,证明目的基因TaNHX2已导人并整合到大豆基因组中,转化率为3.78%.     

转GNA基因小麦新株系的分子检测和抗蚜虫性鉴定

为了进行抗蚜虫转基因小麦的研究，将人工合成的雪花莲凝结素(Galanthus nivlis agglutinin．GNA)基因通过基因枪转入优质小麦品种郑州9405的幼胚愈伤组织，经过在选择培养基上多次筛选，从360块被轰击的愈伤组织中再生到1株Bialaphos(除草剂)抗性植株，命名为G郑州9405。通过连续2代对转化株系进行PCR、Southern检测和蚜虫抗性鉴定，证明GNA基因已经整合到了郑州9405基因组中。目前已经获得了纯合稳定的转基因株系，并在河南农业科学院小麦所进行了环境释放试验。     

大豆胚尖转化体系优化和cry1C*基因转化大豆的研究

以抗大豆食心虫品系东农8004的胚尖为外植体,通过对芽诱导和芽伸长培养基进行优化,建立8004的胚尖转化体系,利用该体系进行cry1C*基因的转化,对获得的抗性再生植株进行分子鉴定和抗虫性鉴定。结果表明:在芽诱导培养基中附加1.67 mg·L-16-BA,丛生芽诱导率最高,达到80%,在芽伸长培养基中附加0.5 mg·L-1GA3和0.1mg·L-1IAA,芽伸长率最高为54%。共获得94株PPT(100μg·m L-1)抗性再生植株,PCR检测阳性14株,阳性率为14.89%。对4株T0代阳性植株进行大豆食心虫抗性鉴定,其中C-1植株的食心虫抗性明显高于野生型8004,说明在大豆中表达cry1C*基因能提高大豆对食心虫的抗性。     

单倍体籼稻无性系微芽的离体调控

 以籼稻单倍体无性系微芽为材料,研究了激素及秋水仙碱等处理对籼稻单倍体微芽的诱导、分化、扩增及加倍的影响。2 mg/L的2,4-D可提高籼稻单倍体微芽的培养力。NAA对籼稻单倍体微芽的扩增有明显影响,0.5 mg/L的NAA可成倍扩增微芽,培养35 d后,其芽数比原始芽数增加了46.21倍,比不加NAA的对照增加了2.8倍,且单芽重仅0.079 mg。籼稻单倍体微芽扩增的适宜培养基为：N6附加MET 2.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L。500 mg/L秋水仙碱溶液处理籼稻单倍体微芽48 h,其二倍体得率较高,绿苗率及二倍体率分别为42.9%和60.0%;秋水仙碱处理愈伤组织的效果不佳,虽然提高秋水仙碱处理浓度可提高二倍体率,最高可达100%,但由于绿苗分化率下降,使总的二倍体得苗率比不处理的对照低。     

利用农杆菌介导法将PVA-CP基因导入马铃薯品种东农303的研究

以马铃薯早熟品种东农303的微型薯为受体材料,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究,成功地将PVA-CP基因导入马铃薯中。结果表明:在加入5mg·L-1ZT和1mg·L-1IAA的培养基上微型薯再生频率最高达95%;农杆菌侵染薯块时,用浓度为OD600=0.5的菌液,侵染5min,共培养2d转化频率最高;在诱导芽阶段加入75mg·L-1的卡那霉素,采用延迟筛选的方法。得到的抗性芽有22株在含100mg·L-1卡那霉素的培养基上生根。经PCR和PCR-Southern杂交检测,15株为阳性植株。初步证明了PVA-CP基因已导入并整合到马铃薯品种东农303的基因组中。     

通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因（cryIA)导入大豆，从发芽5-7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体，经农杆菌感染和共培养后，在选择培养基上4周左右出现抗性不定芽，将不定芽转移到芽伸长培养基上，4-6周后再生苗长至2.5-3cm高，再将再生苗切下转入生根培养基，2周左右生根，生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中，所有植株均能正常开花结英，在移栽成活的8株T0植株中有7株PCR检测呈阳性反应；在7个T1株系中有4个株系存在PCR阳性植株，取4个稳定遗传的T1代株系内的阳性植株的叶片提取DNA，用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析，结果4个株系均呈现阳性，证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。     

通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导入马铃薯

选用两个生产上主栽马铃薯品种“鲁引 1号”和“鲁引 4号”的试管微型薯为材料 ,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯中。试管微型薯薯片与农杆菌共培养 3d后 ,转到含卡那霉素 10 0mg/L的分化培养基上诱导不定芽分化。待抗性芽长到 1 0～ 1 5cm高时 ,转入含卡那霉素 10 0mg/L的液体培养基中进行生根筛选。经过分化和生根两轮筛选的转化植株的PCR检测结果均为阳性 ,而未经转化的对照植株为阴性 ,证明该筛选系统是可靠的。早熟品种鲁引 1号的转化频率明显高于晚熟品种克新 4号 ,其最高转化频率为 4 1 0 % ,平均每个外植体可得到 3 85株转化苗。转化植株的抗病性鉴定正在进行中     

GNA基因遗传转化甘蔗研究

虫害常常给甘蔗生产造成重大损失。GNA对蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式害虫和某些咀嚼式害虫如蛴螬等具有极高的毒性。本研究对引进的GNA基因进行鉴定，并利用基因枪将其转化甘蔗愈伤组织，经筛选、分化，获得了一批抗性再生植株，抽样检测，获得了4株PCR阳性植株，为培育优良抗虫甘蔗新品种创造了条件。     

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25 μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA（+）/nptⅡ（-）/Cre（-）的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%~46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3 d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率（144.44%）也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

转Cry30Fa1基因抗褐飞虱水稻的获得及鉴定

将编码高效杀褐飞虱蛋白的苏云金芽胞杆菌基因Cry30Fa1密码子改造后,通过农杆菌介导法转入蜀恢818(R818),并最终获得46个转基因植株。通过定量PCR及Western Blot鉴定了Cry30Fa1在转录水平和蛋白水平的表达,并通过分子检测固定稳定表达的抗性基因,并结合传统育种系谱法选择具有优良农艺性状株系。对选育的株系在室内和大田环境下进行了抗虫性鉴定,选育的R818-Cry30Fal株系抗性明显优于亲本材料并达到抗的水平;在单株抗虫试验中,观察到了转基因株系对褐飞虱具有致死作用。说明转入Cry30Fa1基因使水稻产生了对褐飞虱抗性。培育出了具有抗褐飞虱蛋白的新型恢复系R818-Cry30Fal,为三系杂交育种提供了新的抗性材料并丰富了抗褐飞虱水稻种质资源。     

Haploid Plantlet Production through Somatic Embryogenesis in Anther-Derived Callus of Bupleurum falcatum

Abstract

This study was carried out to verify the production of haploid plantlets through somatic embryogenesis of Bupleurum falcatum in anther culture (2n=16). Flowers with anthers at the uninucleate stage, less than 200 µm in anther length, were exposed to 10ºC for 5 days (cold pretreatment) and the anthers were cultured on MS medium supplemented with 2,4-D and/or picloram at various concentrations at 30ºC. The optimal supplement for callus formation was a mixture of 0.075 mg L-¹ 2,4-D + 0.075 mg L-¹ picloram or 0.75 mg L-¹ 2,4-D without picloram. Only a few calli were induced from the anthers without cold pretreatment. The calli were transplanted to MS medium without phytohormones and cultured at 25ºC for plant regeneration. Among one hundred twenty root tips of the regenerated plantlets examined, 14.2% were haploid (n=8). However, in the plantlets regenerated from anthers without cold pre-treatment only 2.5% was haploid. In both haploid and diploid regenerated plantlets, the chromosome number was fixed without variation. Among the regenerated plantlets, one was albino. Haploid plantlets were transplanted to the field after acclimation in pots filled with vermiculite under 90% humidity for a month, and haploid plant were produced. The potential of haploid plants derived from anther culture for production of high-yield and good-quality cultivars is discussed.     

利用改良的草丁膦筛选系统快速而有效筛选转基因大豆

为提高大豆(Glycine max(L.)Merrill)遗传转化效率建立了一种快速而有效的草丁膦筛选系统.将刺伤的子叶节外植体接种于含有pCAMBIA3201载体的LBA4404农杆菌溶液.目前利用草丁膦筛选转基因大豆的常规方法是在含有5 mg/L草丁膦的芽诱导培养基和含有3～5 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.利用此常规筛选方法所获得的大多数植株是非转化体,从而导致转化效率变低,为1.6%;而且这种方法极大地延迟了芽的伸长过程,使多数不定芽的伸长发生在农杆菌处理后的21～41周.为此,对常规草丁膦筛选方法进行了改良.首先将外植体放置在不含有除草剂的芽诱导培养基上培养3周,然后转到含有4 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.此时,多数不定芽仅在7～12周内便可伸长.当芽长到3～5 cm时,从外植体上切下来转到含有1～5 mg/L草丁膦的根诱导培养上进行进一步的筛选.结果表明,在添加有3 mg/L草丁膦根培养基上,转化效率达到最大值为6.7%.不定芽对根培养基中的除草剂反应迅速,仅在10d天内所有非转化体都变枯死亡.利用这种改良的筛选系统,大多数转基因植株仅在8～16周内便可获得.Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中.GUS检测和除草剂抗性分析结果表明,被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达.     

抗菌肽B、D双基因表达载体的构建及转化广藿香的研究

将人工合成的柞蚕抗菌肽D基因和天蚕抗菌肽B基因分别接上启动子和终止于，克隆到双元表达载体PBin19上，构建成双价抗菌肽基因表达载体pTBD。用三亲交配的方法将pTBD导入根癌农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌将抗菌肽B、D基因导入广藿香，获27个转基因植株。Southern杂交结果表明，抗菌肽B、D基因已同时整合进3个株系染色体组中。与病原细菌Pseudomonassolanacearum试管共培养结果表明，转基因植株获得较强抗病性。盆栽接菌试验结果也表明．转基因植株具有较强抗病性。     

根癌农杆菌介导大果西番莲基因转化

以大果西番莲种子无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,在添加不同质量浓度BA和IAA的MS系列培养基上进行不定芽的诱导,确定MS+BA2.0mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1为最适的不定芽诱导培养基,下胚轴、子叶外植体诱导芽分化率分别为88.33％,90.00％。将诱导出的不定芽接种在添加不同质量浓度IBA和NAA的MS系列培养基上,进行不定根的诱导,确定MS+NAA0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1为最适的不定根诱导培养基,生根率达92.86％。用三亲交配法将质粒pBICr先转移到E.coli DH5α,然后转移到根癌农杆菌。利用含有NPT-Ⅱ基因和CaMV35S启动子控制下的黄瓜花叶病毒外壳蛋白（CMV-CP）反义基因的表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其导入西番莲受体细胞,在质量浓度为50mg·L-1的Kan+选择压力下培养,获得大果西番莲CP转基因再生植株。      

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

柑桔栽培品种高效基因转化新技术研究

采用试管实生苗去芽创伤－农杆菌感染法,将人工合成的抗菌肽基因转入柑桔栽培品种,利用后期筛选和Ｐｅｒａｆｉｌｍ包缠法,提高了转化效率。拟转化植株的叶圆片抗Ｋａｎ能力分析结果表明,锦橙、新会橙和沙田袖的转化效率分别达到４６．３％,３９．５％和４３．７％。根据对 Ｋａｎ阳性植株的ＰＣＲ分析,证明有抗菌肽基因出现。结果表明,这是一种简便、高效、重复性好的实用基因转化方法。     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.