中国野生华东葡萄芪合成酶基因启动子转化番茄的研究

中国野生华东葡萄"白河-35-1"中的芪合成酶基因启动子被证明具有病原菌和胁迫诱导表达活性。现将芪合成酶基因置于增添不同增强子的该启动子下,构建4个植物表达载体,通过农杆菌介导法进行了转化番茄的研究,并对转基因株系抗番茄灰霉病表现及其白藜芦醇含量变化进行了测定。结果表明:经PCR-Southern鉴定,获得转基因株系4个共54株;不同载体转化的番茄株系对灰霉病抗性均高于野生型,但抗性存在差异;添加增强元件enhancer启动子启动的芪合成酶基因表达的番茄株系,可使白藜芦醇含量提高4.4倍。     

野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析

【目的】研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’(Vitis quinquangularis‘Danfeng-2’)芪合成酶(stilbene synthase)基因双向启动子的启动活性与差异。【方法】通过染色体步移技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子,并与Uid A基因(β-葡萄糖苷酶基因,GUS)融合,利用真空渗透法在葡萄叶片中瞬时表达,组织化学染色和GUS蛋白定量法分别检测白粉菌接种、温度处理、茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸处理对双向启动子活性的影响。以毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲葡萄‘赤霞珠’不同成熟时期果实的c DNA为模板,通过荧光实时定量PCR的方法分析Vq STS12/Vv STS31和Vq STS33/Vv STS32的表达情况。【结果】Pvq DSTS12受到白粉菌、茉莉酸甲酯、高温和低温的诱导后,启动活性增强,对水杨酸和脱落酸处理不敏感;Pvq DSTS33在茉莉酸甲酯处理下启动活性增强,在高温和低温的处理下启动活性降低,对水杨酸、脱落酸和白粉病处理不敏感。荧光实时定量PCR结果显示,在果实发育的6个时期中,‘丹凤-2’Vq STS12和Vq STS33的表达量均高于‘赤霞珠’Vv STS31和Vv STS32。4个基因的基本表达趋势为:浆果转色期之前持续增长,转色后期下降,浆果半熟期达到最高峰,浆果成熟期表达降低。其中毛葡萄‘丹凤-2’Vq STS12的表达量在转色后期并未降低且增加到上一时期的2.3倍;欧洲葡萄Vv STS32基因在成熟期表达量升高为前一时期的1.42倍。【结论】双向启动子活性的研究为利用植物天然双向启动子提供依据。     

中国野生葡萄芪合成酶基因STS19及其启动子的克隆与功能分析

以中国野生山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）‘通化3号’和刺葡萄（V. davidii Foex.）‘塘尾’为材料,克隆得到芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19。序列分析发现VaSTS19和VdSTS19的编码区均为1 179 bp,编码392个氨基酸,定位于16号染色体,二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.81%和98.21%。亚细胞定位结果显示VaSTS19和VdSTS19均定位于细胞膜、细胞质和细胞核。将35S强启动子连接VaSTS19和VdSTS19转入番茄能显著促进STS19的表达及番茄中白藜芦醇的合成和积累。分别从两种材料中克隆得到VaSTS19和VdSTS19的启动子。顺式作用元件分析表明,二者启动子中均包含多个胁迫应答元件、激素应答元件及光应答元件。序列分析发现二者启动子序列与欧洲葡萄VST2启动子序列同源性为60%。转基因烟草叶片中二者不同长度启动子片段对SA和MeJA诱导响应明显。结果表明STS19的表达模式和白藜芦醇的合成可能与其上游启动子类型和调控有关。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤–2’白藜芦醇含量高,并抗白粉病。以此为材料,利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因VqSTS12和VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化,分别获得7个VqSTS12和5个VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量PCR分析发现,与野生型植株相比,转基因植株中芪合酶基因STS与下游白藜芦醇糖基转移酶基因RSGT表达量升高,与STS有底物竞争关系的查尔酮合酶基因CHS表达量降低。STS的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现,转基因植株对白粉菌的敏感性降低,发病较晚,病情较轻,在转基因植株上部分孢子萌发受抑制,菌丝发育迟缓。转基因植株中VqSTS12和VqSTS25受白粉菌诱导表达:在接菌后1～3 d内表达量显著升高,随后略有下降,在6～7 d表达量再次上升。同时高效液相色谱(HPLC)检测到STS的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄VqSTS12和VqSTS25及其表...     

葡萄卷叶病对‘赤霞珠’葡萄品质的影响

【目的】探讨葡萄卷叶病对酿酒葡萄果实品质指标的影响。【方法】以未表现卷叶病症状的‘赤霞珠’葡萄为对照,在成熟期测定了感染卷叶病‘赤霞珠’葡萄果粒的大小、可溶性固形物含量,采用高效液相色谱法(HPLC)测定葡萄可溶性糖含量、有机酸含量和花色苷含量。【结果】卷叶病使葡萄果实的大小和质量、可溶性固形物含量显著降低;可溶性糖含量显著降低,葡萄糖和果糖的总量仅为对照组葡萄的69.29%;有机酸总量略微升高,但未达到显著水平,染病葡萄果皮和果肉中的草酸含量显著降低,苹果酸含量显著升高;5种基本花色苷单体的含量显著降低,总量仅为对照组‘赤霞珠’葡萄果皮单体总量的26.12%。其中,矢车菊素类花色苷所占比例降低,甲基化类花色苷所占的比例升高。【结论】葡萄卷叶病导致‘赤霞珠’葡萄着色不良,品质严重下降。     

4个圆叶葡萄品种在桂中地区引种表现及栽培技术

对引种于广西农业科学院的4个圆叶葡萄品种从植物学特点、物候期、结果习性、果实外观、抗病性和抗虫性进行观察和研究,从表现上看,4个圆叶葡萄品种对桂中高温高湿气候适应性较强,长势较强,抗性好,风味独特,其中以‘Fry’鲜食口感较好,果粒大,丰产性好。     

‘嘎啦’苹果MYB12基因启动子的克隆与功能分析

以‘嘎啦’苹果基因组为模板,用PCR方法扩增得到苹果MYB12基因启动子(ProMYB12)。利用在线分析网站Plant CARE和PLACE对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测。构建pCAMBI0390-ProMYB12-GUS植物瞬时表达载体并转化农杆菌,瞬时转染野生型番茄Micro-Tom(Lycopersion esculentumcv.Micro-Tom)用以研究启动子的启动活性。结果表明:克隆获得的启动子长度为1 290bp。启动子序列中存在大量的顺式作用元件,既有转录必备的TATA-box和CAAT-box,也存在非生物胁迫和植物激素响应元件以及大量的光调控元件,此外还存在一些组织特异性表达元件。‘嘎啦’苹果MYB12启动子驱动的GUS基因在番茄的花和种子处有较高的表达量,表现出一定的组织特异性。     

中国野生葡萄抗霜霉病相关基因VpPR4b及其启动子的克隆和功能分析

以中国野生葡萄(Vitis piasezkii)‘留坝–8’(抗霜霉病)和欧亚种葡萄(V. vinifera)‘黑比诺’(易感霜霉病)为材料,克隆得到抗霜霉病相关基因VpPR4b和VvPR4b。序列分析发现VpPR4b和VvPR4b核苷酸序列相似性为98.61%。VpPR4b编码区为432 bp,编码143个氨基酸,含有BARWIN保守结构域,属于典型的Ⅱ型PR4蛋白。VpPR4b和VvPR4b均可在霜霉菌侵染后诱导表达。亚细胞定位表明VpPR4b定位于细胞膜上。分别从‘留坝–8’和‘黑比诺’中克隆得到了VpPR4b和VvPR4b的启动子,其序列相似性高达95.65%,并且含有相似的顺式作用元件。通过酵母单杂交验证了转录因子WRKY40和WRKY75可以结合VpPR4b启动子。本研究的结果表明PR4b可能在葡萄抵御霜霉病侵染过程中发挥一定作用。     

油菜种子特异启动子Napin控制外源EGFP基因在芥菜中的表达

为研究油菜种子特异启动子Napin在芥菜中的表达特性,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因,将其置于来自油菜的Napin启动子下游,并经根癌农杆菌介导转入芥菜。对转基因芥菜种子及其T1代幼苗的EGFP检测表明：随着转基因植株的种子逐渐发育成熟,EGFP基因在种皮、子叶、胚根中的表达强度逐渐增强|在转基因种子发芽过程中,幼苗根、子叶、下胚轴中EGFP的表达逐渐降低,直至不能检出绿色荧光。结果表明Napin启动子驱动的外源基因表达在芥菜中表现出较为严格的种子表达特异性。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

水杨酸对感染卷叶病毒‘蛇龙珠’葡萄光合作用和果实品质的影响

为了提高感染卷叶病毒的酿酒葡萄品质,试验以感染卷叶病毒的‘蛇龙珠’葡萄为试材,研究叶面喷施不同浓度水杨酸对葡萄叶片光合作用、果实品质的影响。结果表明:水杨酸处理不能显著抑制葡萄叶片中卷叶病毒的侵染,但可以提高叶片叶绿素含量和净光合速率,提高果实中转化酶活性,促进糖分积累;葡萄谢花后20 mg/L水杨酸处理显著提高了叶片叶绿素含量和1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rbuisco)活性,叶片净光合速率显著升高,同时也显著提高了果实中转化酶活性,提升果实品质。因此,葡萄谢花后适宜浓度的水杨酸处理可以通过提高叶片光合能力和果实中糖分积累相关酶活性来提高感染卷叶病毒葡萄的果实品质。     

山葡萄‘双丰’和‘左优红’叶绿素荧光特性及活性氧代谢与低温伤害的关系

为探明山葡萄叶片低温伤害的生理机制,以抗寒性差异明显的‘双丰’(山葡萄种内杂交种)和‘左优红’(种间杂交种)为试材,对低温处理过程中叶绿素荧光参数和活性氧代谢的相关指标进行测定。结果表明,随低温胁迫加剧,两个品种叶片的叶绿素含量、Chl.a/b、Fv/Fm值均呈显著下降趋势,1–qp值及MDA含量明显增加;整个胁迫过程中NPQ值较稳定的‘双丰’其叶片遭受低温伤害程度较轻,NPQ值一直下降的‘左优红’叶片伤害程度较重,‘双丰’的NPQ值始终显著高于‘左优红’。‘双丰’叶片的SOD和APX活性始终较‘左优红’高。说明低温使山葡萄叶片叶绿素分解,PSⅡ电子传递受阻,激发能增加,造成叶绿体膜脂过氧化损伤;热耗散及抗氧化酶共同作用减轻了活性氧对叶片PSⅡ的伤害程度。由此可见,热耗散NPQ值及活性氧清除酶SOD和APX活性的差异可能是造成两个山葡萄品种叶片低温伤害程度不同的重要原因。     

生物农药阿泰灵在‘玫瑰香’葡萄上的应用效果

为了实现葡萄绿色防控、优质高效生产,保障种植者的收益,采用生物药剂阿泰灵在‘玫瑰香’葡萄上进行试验研究,通过不同浸根方式(0.1%阿泰灵、清水、对照)、不同浓度喷施(0.05%阿泰灵、0.1%阿泰灵、0.15%阿泰灵、0.2%阿泰灵、清水、对照)、不同浓度灌根(0.05%阿泰灵、0.1%阿泰灵、0.15%阿泰灵、0.2%阿泰灵、清水、对照)、不同施用方式(0.1%阿泰灵喷施、0.1%阿泰灵灌根、0.1%阿泰灵浸根+0.1%阿泰灵喷施、清水喷施、清水灌根、对照)对葡萄进行处理,测定其栽植成活率、葡萄霜霉病染病率及株高、枝条成熟情况等。结果表明:将生物药剂阿泰灵应用在‘玫瑰香’葡萄上,葡萄植株的霜霉病发病率明显降低,喷施效果好于灌根;在苗木栽植时用0.1%阿泰灵进行浸根,长出叶片后用0.1%阿泰灵进行叶面喷施,可显著降低霜霉病染病率,并提高其枝条成熟度。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。     

外源褪黑素对臭氧胁迫下‘赤霞珠’葡萄叶片光合作用的影响

以盆栽‘赤霞珠’葡萄为试验材料,浇施浓度为100 nmol·L~(-1)的外源褪黑素(melatonin)后,在110 n L·L~(-1)臭氧浓度胁迫下,测定葡萄叶片气体交换参数和叶绿素荧光快速诱导动力学曲线,并结合叶绿素荧光淬灭分析葡萄叶片光合性能的变化。结果表明:浇施褪黑素提高了臭氧胁迫下叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量以及叶绿素a/b的比值,提高了叶片净光合速率(P_n)和叶片单位面积有活性反应中心的数量(RC/CSm),以及捕获的激子将电子传递到Q_A以后的其他电子受体的概率(Ψ_o),从而缓解了臭氧胁迫下的光抑制程度。结论:外源褪黑素缓解了臭氧胁迫下葡萄叶片叶绿素的降解,通过调节光系统的能量分配,缓解了臭氧胁迫对光合作用的伤害。     

应用绿色荧光蛋白报告基因优化辣椒的遗传转化体系

 以‘中椒5 号’甜椒和‘湘研10 号’辣椒子叶外植体为试料, 绿色荧光蛋白GFP 基因为报告基因, 通过观察检测愈伤组织的荧光表达与特异PCR 扩增鉴定, 分析了工程菌液pH 值、共培养基中乙酰丁香酮(AS) 的浓度、共培养时的温度与共培养时间对农杆菌转化辣椒效率的影响。结果表明, 在pH5.2、共培养基中加入AS 200 μmol·L ^{- 1} 、23 ℃黑暗条件下, 农杆菌与辣椒子叶共培养5 d , 有利于辣椒子叶的遗传转化,‘中椒5 号’、‘湘研10 号’愈伤组织荧光表达率均达到了40 %。     

ABA对‘巨峰’葡萄采后成熟关键基因表达的影响

利用ABA、NDGA(Nordihydroguaiaretictic acid,NCED酶抑制剂)和氟啶酮(Fluridone)、乙烯利和AS6(3’-hexylsulfanyl-ABA,PYL-PP2C受体拮抗剂)处理‘巨峰’葡萄采后果实,分析果实硬度、花色苷、芳香挥发物及相关基因表达量等的变化。结果表明,ABA可促进花色苷、可溶性固形物和香气挥发物形成,降低可滴定酸含量与果实硬度。NDGA、氟啶酮、AS6的效果与ABA相反。VvMYBA2、VvUFGT和VvEGS1的表达可促进花色苷的积累和芳香挥发物的形成,而Vv LAR1则减少花色苷积累。施加外源ABA,可促进果实内源ABA含量增加和VvOPR3、VvACO1和VvSUT11的表达;AS6处理也可增加内源性ABA含量,而NDGA、氟啶酮则相反。VvNCED1、VvCYP707A1、VvPYL8的表达与内源ABA含量基本一致,相比之下,AS6可下调V PYL8表达量。VvPP2C49的表达变化与内源ABA相反,AS6促进VvPP2C49表达。这些结果表明果实内源ABA含量影响花色苷、香气挥发产物的形成,促进果实软化和糖代谢。     

根癌农杆菌介导的‘魏可’葡萄遗传转化体系的优化

以‘魏可’葡萄离体叶片为外植体,利用植物表达载体上含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIA2301)对影响‘魏可’葡萄遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,最佳农杆菌介导‘魏可’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,卡那霉素质量浓度5 mg·L-1,羧苄青霉素质量浓度200 mg·L-1。采用此体系对‘魏可’葡萄进行转化,共获得9株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法检测,结果表明,有4株通过了PCR检测,1株通过了RT-PCR检测,初步证明nptⅡ基因已经整合进入‘魏可’葡萄基因组中。将PCR产物回收,经测序验证nptⅡ基因完全整合进入‘魏可’葡萄基因组中。对CK及经PCR检测呈阳性的株系进行卡那霉素抗性鉴定,发现PCR呈阳性的株系均比CK抗Kan的能力明显增强。     

‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析

以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料,利用同源克隆法获得1个NAC转录因子,命名为VvDRL1（GenBank：XP-002281816）。该基因全长840 bp,编码280个氨基酸,与‘黑比诺’葡萄中该基因的同源性为100%,但是基因组DNA序列中存在6处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,VvDRL1基因主要在细胞核内表达,属于核蛋白;通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因烟草,T2代转基因植株生长迟缓,株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的60%、34%和31%,转基因植株叶片出现向内卷曲现象,利用石蜡切片进行显微结构观察,转基因植株主叶脉上表皮下缺失2 ~ 3层厚壁细胞,且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明,VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。