小麦条锈菌效应蛋白基因pst-2511的克隆、 表达和初步结构研究

对小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici）效应蛋白pst-2511进行研究,分析其可能形成二级结构的条件,为以后通过核磁方法解析该效应蛋白的三维结构提供基础。构建了小麦条锈菌效应蛋白基因pst-2511的原核表达载体pET-32a-PP-pst-2511,并成功将其在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行原核表达;表达出的蛋白用亲和层析法和高效液相色谱法进行纯化,获得可溶性的效应蛋白,用凝胶电泳检测得到单一条带,经质谱鉴定,纯化后的蛋白质分子量与理论值符合。圆二色谱表征该蛋白质的二级结构有α螺旋,且随着三氟乙醇（TFE）浓度的增加,α螺旋比例增加。对效应蛋白pst-2511的初步结构研究及三维结构解析,可以为防止小麦条锈病提供理论依据,同时为深入研究效应蛋白的调控通路以及阐明条锈菌侵染机制和更有效地防止小麦条锈病提供帮助。     

小麦条锈菌效应蛋白Pst-1374的表达纯化及初步结构特征

由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst）引起的条锈病是小麦上最具破坏性的病害之一。在条锈菌侵染小麦过程中,条锈菌向小麦细胞分泌效应蛋白,改变宿主的防御反应。效应蛋白Pst-1374来源于条锈菌小种PST-78,将Pst-1374基因插入pET-32a载体并在大肠杆菌中表达,使用镍柱亲和层析和高效液相色谱（HPLC）纯化重组效应蛋白Pst-1374,然后通过液质联用质谱（LC-MS）、动态光散射（DLS）、凝胶过滤层析（GFC）和圆二色谱（CD）研究了Pst-1374的结构特征。结果表明,溶液中的Pst-1374大部分为无规则卷曲结构,只有小部分为规则的二级结构;三氟乙醇（TFE）可以稳定Pst-1374的结构,增加α-螺旋的比例。这些结构特点的发现为其他效应蛋白的结构研究提供了思路。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定

【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。     

卵形鲳鲹 JAK3 蛋白的原核表达与纯化

【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB、3A基因的克隆与原核表达

以构建的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC质粒pGEM-T-3ABC为模板,设计了特异性的引物,进行RT-PCR扩增得到非结构蛋白3AB、3A基因,然后分别定向克隆到原核表达载体pET-28a、pET-41a载体上,将重组质粒转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,证明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

拟南芥SEPALLATA3蛋白质原核表达与纯化

SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表明AtSEP3蛋白以四聚体形式存在。图4参13     

重组鸡细胞外脂肪酸结合蛋白的原核表达及鉴定

细胞外脂肪酸结合蛋白(Extracellular Fatty Acid-Binding Protein,Ex-FABP)是一种鸡胚发育过程中表达于肥大软骨、肌肉纤维和血粒细胞中的脂蛋白,大小约为21 ku。试验通过构建Ex-FABP原核表达载体,以实现Ex-FABP蛋白的大量表达,并对其进行纯化及鉴定;以艾维茵肉鸡胫骨软骨总RNA为模板,RT-PCR扩增ExFABP基因,连接pGEM-T克隆载体后,再与载体pET-28a连接并转化,获得含pET-28a-Ex-FABP重组表达质粒的Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株;使用IPTG诱导表达蛋白,SDS-PAGE鉴定表达情况,利用镍柱亲和层析法纯化蛋白,对纯化蛋白进行Western Blot鉴定。结果表明,试验成功构建重组表达载体pET-28a-Ex-FABP;表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果显示,目的蛋白在24 ku附近出现特异性条带,表明表达蛋白正确。试验成功表达了大量纯度比较高的Ex-FABP蛋白,可为后续的动物试验以及家禽疾病的研究提供理论依据。     

人癌症/睾丸相关蛋白XAGE-1b原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的构建人癌症/睾丸相关蛋白XAGE-1b原核表达载体及诱导XAGE-1融合蛋白表达。方法从文库质粒pACT2-XAGE-1b中利用PCR法扩增XAGE-b cDNA编码序列,将其克隆到pET-32a载体中,并将重组质粒pET-32bXAGE-1b转染大肠杆菌DE3中,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测融合蛋白表达。结果原核表达载体pET-32a-XAGE-1b构建成功;转染菌株经IPTG诱导后,出现约29 kD蛋白过表达,Western-blot检测显示His6融合蛋白表达。结论成功构建原核表达载体pET-32a-XAGE-1b,转染菌株可表达His6融合蛋白。     

C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板，测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析，并对抗原表位进行预测，结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物，分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因，分别用pET-28a表达载体进行重组后，获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达，b段表达较高，可溶性表达较好，纯化后，可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性，并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强，可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质的影响

【目的】探讨不同授粉品种对苹果品质和香气物质成分差异的影响,为高效授粉树的选育和苹果品质的提高提供依据。【方法】采用自育高效授粉树‘红菱’‘红锦’‘红雾’的花粉,在‘富士’(Malus domestica‘Fuji’)、‘新红星’(M.domestica‘Starkrimson’)铃铛花期进行授粉,以授‘嘎拉’(M.domestica‘Gala’)花粉的果实为对照,对果实发育期间总类黄酮含量的变化进行研究,并在果实成熟时测定可溶性固形物、花色苷含量等品质指标及香气物质成分。【结果】不同的授粉品种条件下,‘富士’和‘新红星’苹果除可滴定酸外的各项品质指标均高于对照。‘富士’苹果经‘红菱’授粉后,其果形指数、硬度、花色苷、可溶性糖含量显著提高,分别为对照的1.12、1.15、1.28、1.12倍。‘新红星’苹果经‘红雾’授粉后,其单果重、果形指数、花色苷、可溶性固形物、可溶性糖含量均显著提高,分别为对照的1.22、1.12、2.48、1.10、1.11倍,其可滴定酸含量显著降低,仅为对照的75%。在果实发育的整个生长期内,不同授粉品种处理的‘富士’和‘新红星’苹果总类黄酮含量均高于对照,且不同品种间存在显著差异。在花后160 d,‘富士’经‘红菱’‘红锦’‘红雾’花粉授粉后,果实内总类黄酮含量与对照相比分别增长19.63%、28.72%、13.97%,‘新红星’在花后120 d分别增长14.18%、15.26%、4.24%,差异显著。‘红菱’‘红雾’‘红锦’和对照授粉处理的‘富士’和‘新红星’苹果总酯类挥发性物质的相对含量分别为50.20%、52.03%、42.68%、45.10%和71.08%、68.85%、71.83%、66.03%,‘红菱’授粉后‘富士’‘新红星’果实总酯类挥发性物质含量明显增加,其中2-甲基丁酸乙酯的含量分别为对照的1.14和203.91倍。‘富士’苹果中,‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉处理的果实乙酸-2-甲基丁酯的含量分别为对照的1.73、1.07、1.36倍;其己酸乙酯和乙酸丁酯的含量分别为对照的1.09、1.12、1.29倍和1.50、0.77、1.30倍。而在‘新红星’苹果中,经‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉后,乙酸-2-甲基丁酯和己酸乙酯的含量分别为对照的1.82、1.27、0.93倍和2.57、1.15、0.27倍;乙酸丁酯的含量分别为对照的7.83、3.48、3.30倍。此外,‘富士’和‘新红星’苹果经‘红菱’授粉后,其烃类物质含量明显高于对照,主要表现为法呢烯的增多。【结论】高效授粉树能显著提高‘富士’和‘新红星’苹果的外观和内在品质,并且与对照存在显著差异。不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质影响差异较大,经‘红菱’授粉,‘富士’和‘新红星’苹果品质有显著提高。     

Characterisation of Neonicotinoid and Pymetrozine Resistance in Strains of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from China

Four strains of the Q biotype and one of the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci collected from China were characterised for resistance to four neonicotinoid insecticides and pymetrozine. Q biotype strains showed moderate to strong resistance to imidacloprid, thiamethoxam and acetamiprid, but little or no cross-resistance to dinotefuron. Resistance to neonicotinoids was consistently associated with resistance to pymetrozine, despite the latter having a distinct (though unresolved) mode of action. The single B biotype strain proved largely susceptible to all the insecticides investigated. Resistance in the Q biotype strains was associated with over-expression of a cytochrome P450 monooxygenase gene, CYP6CM1, whose substrate specificity presumably accounts for the observed cross-resistance profiles.     

贵州山区做好玉米区域试验的经验与方法

玉米区域试验是在不同生态条件下,对新育成品种的丰产性、稳产性、抗逆性、适应性及品质性状等进行全面鉴定和综合评价的中间环节,是新育成品种能否通过审定推广的重要过程,是农业科研与农业生产的重要纽带,是新品种是否能在本地区推广应用的科学依据,做好玉米区域试验事关重大.     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.     

氮、磷、钾、硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及经济效益的影响

 【目的】指导当前生产条件下江西油菜测土配方施肥技术的推广。【方法】2008—2009年在江西省设置12个田间试验,研究氮、磷、钾和硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及其相关性状的影响,并对施肥经济效益进行分析。【结果】氮磷钾硼肥配施处理(NPKB)平均产量为2 015 kg?hm-2,与不施肥相比,NPKB、缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB)和缺N(PKB)分别增产1 121、839、758、746和249 kg?hm-2;NPKB配施处理下各主要经济性状表现较好,有利于对N、P、K、B素的吸收利用;效益分析表明,NPKB配施效益达到5 449.5元/hm2,比不施肥增收2 231.1元/hm2,其次是缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB),分别比不施肥增收1 298.4、1 280.7和1 541.1元/hm2,而不施氮肥的处理减收206.1元/hm2。【结论】NPKB配施对甘蓝型杂交油菜增产、增收效果显著,是保证高效生产的技术关键。