云南苹果树腐烂病菌分离株生物学特性和致病性研究

本研究采集分离获得云南昭通、丽江、曲靖马龙和昆明团结乡等苹果产区的苹果树腐烂病病斑上分离得到分离物,从中选取不同地点、在PDA培养基上不同性状的18个分离株作为研究对象,研究其培养性状。结果表明,18个云南分离株均为致病种Valsa.ceratosperma,种间各分离株在PDA培养基上的菌落颜色存在差异,其中易产孢的4个分离株为灰褐色菌落类群、8个分离株为黄褐色菌落类群、6个分离株为乳白色的菌落类群。所有分离株在0℃下都不能生长,在28~32℃生长良好。灰褐色和乳白色类群菌株耐高温,黄褐色类群菌株对高温低温的抵抗力较弱。提取各病原分离株DNA和进行PCR,r DNA-ITS序列,结果显示苹果树腐烂病菌的云南18个分离株的r DNA-ITS序列包含了2个单倍型,均为致病种V.ceratosperma。其中分离株NL-3、NL-4和NL-15的序列完全相同,为同一个序列型Ha1,其余15个分离株的序列完全相同为同一个序列型Ha2。比较云南分离物与其他分离物的相应序列,结果显示云南的18个分离株与山东淄博分离株(GQ865689)和日本分离株(AF192326)聚为一类,2分支,日本分离株独为1支,对应腐烂病菌V.ceratosperma,其余3个类群分别为V.malicola、V.mali和外群。r DNA-ITS序列分析结果显示云南分离物具有相似的遗传背景和来源。菌株致病性研究表明云南分离物菌株间致病力存在显著差异,黄褐色类群菌落的菌株的致病性较灰褐色菌落和乳白色菌落的类群的菌株强,而灰褐色菌落类型和乳白色菌落类型的致病性差异不明显。研究表明云南各地区大部分苹果树腐烂病的致病株均属于中国苹果树腐烂病菌的优势种类V.ceraterapema,其种内出现了明显的菌群分化和致病力分化现象。     

河北省苹果树腐烂病菌不同分离株生物学性状及致病性研究

为了明确河北省苹果树腐烂病病原菌的类型及致病性分化情况,从河北省8个苹果产区采集罹病样本,分离得到153株苹果树腐烂病菌,并根据菌落颜色、菌丝生长速率和疏密程度选取其中具有明显特征差异的12个代表性菌株进行了致病性测定.结果表明,河北省各地区苹果树腐烂病菌的菌落颜色分为7个类群,主要为浅黄色和黄色;不同分离株在菌丝生长速率和菌丝疏密程度上也存在较大差异,其中70.59％的菌株生长速率为中等,57.52％的菌株气生菌丝发达.不同颜色菌株的致病力有显著差异,在菌丝生长速率接近的情况下,浅黄色和黄白色菌株致病力较强;菌落颜色相同而菌丝生长速率不同的菌株间致病力也有显著差异,且致病力强弱与生长速率呈正相关;菌丝疏密程度对菌株致病力的影响不明显.以上试验结果均表明,河北省苹果树腐烂病病原菌具有多样性和致病性分化现象.     

不同寄主来源腐烂病菌对苹果树致病性研究

[目的]研究不同寄主来源腐烂病菌对苹果树的致病性,确定苹果树腐烂病菌侵染来源,为制定病害防治策略及降低发病率提供理论依据.[方法]将来源于梨树、苹果、杨树、沙枣、胡杨、枣树、柳树及核桃腐烂病菌,接种于30;苹果树皮培养基、苹果果实、叶片、离体枝条及田间枝条上观察产孢情况,并计算发病率、病斑扩展速率.[结果]来源于梨树和胡杨树腐烂病菌在果实上侵染速度最快且能形成产孢体.来源于梨树、胡杨、枣树的腐烂病菌能在离体枝条上吐出分生孢子角.来源于胡杨和柳树的腐烂病菌未能侵染苹果叶片.来源于苹果、胡杨、枣树的腐烂病菌能成功侵染田间枝条且在20 d内吐出黄色分生孢子角.[结论]不同寄主来源的腐烂病病菌均能在30;苹果树皮培养基上形成产孢体,能成功侵染果实、叶片及离体枝条,但在病斑扩展速率和产孢能力等方面存在明显差异.来源于梨树、苹果、胡杨、红枣的病原菌均能在苹果田间枝条上侵染成功.     

苹果树腐烂病菌挥发性代谢物及其毒素活性

研究苹果树腐烂病菌代谢产生的挥发性物质及其毒素活性。通过在树皮培养基中培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,并利用苹果枝条对其标准物质进行毒素活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生5种挥发性物质,分别为2-氟丙烯、异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚,其中异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚均对苹果树枝具有毒素活性。苹果树腐烂病菌产生的挥发性代谢产物对苹果树具有毒素活性,为苹果树腐烂病菌致病机理的探索提供新的思路与方向。     

苹果树腐烂病菌活性物质的提取分离及结构鉴定

为探索苹果树腐烂病菌(Valsa mali)野生型菌株03-8产生的活性物质及其与致病性的关系,在以蔗糖为碳源的MS液体培养基中25℃静置培养20d,利用大孔树脂吸附、二氯甲烷萃取、薄层层析和高效液相色谱等手段分离纯化,~1H-NMR、~(13)C-NMR、DEPT135、HMQC谱对纯化合物进行结构鉴定,并测定其生物活性。最终分离得到一个化合物D-2;结构鉴定为1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇;该化合物1mg/mL的丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液不能在烟草和苹果叶片上引起坏死斑,但对枯草芽孢杆菌有抑制作用。     

苹果树腐烂病菌分生孢子产生条件研究

[目的]为了给生产实践中苹果树腐烂病研究提供一种获得分生孢子的方法。[方法]在室内测试苹果树腐烂病菌在6种培养基上的分生孢子产生条件,比较每种培养基上产生的分生孢子器个数、密度、大小、成熟率以及单个分生孢子器所含孢子数量等。[结果]PDA（添加马铃薯）、ABA（添加苹果树皮）培养基在各项参数对比中显著优于其他培养基。其中,PDA上产生的分生孢子器数量最多,ABA上产生的分生孢子器成熟率最高,产生成熟子实体的时间最短;黑光灯照射（紫外照度为53.5μW/cm2）有利于苹果树腐烂病菌分生孢子器的产生和成熟。[结论]提供了一种较为方便的室内获得苹果树腐烂病孢子的方法。     

苹果树腐烂病菌分生孢子萌发及其影响条件研究

由于苹果树腐烂病菌分生孢子在清水中不能萌发,因此采用在PDA培养基上涂布孢子悬浮液使其萌发的方法,研究了不同温度、湿度、pH及光照对其分生孢子萌发的影响。结果表明,苹果树腐烂病菌分生孢子在15~28℃的温度范围内都可以萌发,最佳的萌发温度为25~28℃。分生孢子的萌发需要饱和的相对湿度。分生孢子萌发的酸碱度范围为pH 2.14~7.10,最适pH为5.10~6.10。营养条件对腐烂病菌分生孢子的萌发有明显的影响。虽然在连续黑暗条件下,腐烂病菌分生孢子的萌发率较连续光照和光暗交替条件下略高,但各种光照处理对孢子萌发率的影响不明显。     

钾元素对苹果树腐烂病菌生长发育的影响

本研究在室内测试了不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌生长速率、菌丝形态、菌丝干重、分生孢子萌发及致病力的影响,旨在为寻找更有效的抗腐烂病菌靶标提供理论基础。在基础培养基PDA和PDB中分别添加不同量KCl粉剂,配制成含不同浓度钾的培养基,通过生长速率法、菌丝干重法、孢子萌发法和伤口接种法研究钾元素对腐烂病菌的影响。结果表明：纯钾浓度低于9.04 g/L时能促进腐烂病菌菌丝生长,当浓度高于9.04g/L时则抑制菌丝生长,同时,该浓度下的分生孢子孢子萌发率也出现显著下降。当纯钾浓度达到12.82 g/L时,腐烂病菌菌丝生长、孢子萌发和致病性都受到显著抑制;从19.16 g/L高浓度钾处理菌株接种的病果上分离获得的腐烂病菌菌株KVm470,其致病力与野生型Vm470相比显著下降。因此,树体中保持合理浓度的钾含量除了提高树体抗病性之外,还能够显著抑制腐烂病菌的侵染和扩展,而且,钾元素对腐烂病菌致病力的影响具有一定程度的可遗传性。     

苹果树腐烂病菌qPCR检测方法的建立

利用ITS、β-微管蛋白和EF-1α基因序列的通用引物来扩增苹果树腐烂病菌菌株Vmm41,产物序列,与GenBank中的序列对比,设计并筛选出特异性引物对VE1-F/VE1-R。将目的片段连接到载体pUC19上制成标准品,通过优化退火温度和引物浓度,建立了实时定量PCR检测体系,并对该体系的特异性、灵敏度和可靠性进行了验证。结果表明,该体系可检测到26.4fg/μL的模板浓度,并可从苹果轮纹病菌、链格孢菌、层出镰刀菌、木霉菌和青霉菌等苹果园常见真菌中特异性的检测出苹果树腐烂病菌。用该体系对人工接种腐烂病菌的苹果叶片进行检测验证,结果表明,利用该检测体系可检测出叶片未发病部分的腐烂病菌数量。本研究建立的定量PCR检测体系可用于苹果树腐烂病菌的快速检测,为苹果树腐烂病侵染规律及预警研究提供新方法。     

苹果树腐烂病菌拮抗细菌筛选及鉴定

【目的】筛选对苹果树腐烂病菌具有较高抑菌活性的拮抗细菌,为苹果树腐烂病的生物防治提供理论依据.【方法】采用平板对峙法及生长速率法对分离自苹果树根际土壤和发病枝条的细菌进行筛选,并根据形态学与分子生物学对抑菌活性较高的菌株进行鉴定.【结果】共分离出13株细菌,其中QYTR-2对苹果树腐烂病菌的抑菌率最高,为82%,明显高于其他菌株.菌株QYTR-2不同稀释倍数的发酵滤液对苹果树腐烂病菌均有一定的抑制作用,其中5倍发酵滤液抑菌率最高,达92.23%.结合形态学和分子生物学技术鉴定该菌为嗜麦芽寡氧单胞菌Stenotrophomonas maltophilia.【结论】拮抗细菌QYTR-2(Stenotrophomonas maltophilia)对苹果树腐烂病菌具有良好的抑制作用,研究结果对丰富苹果树腐烂病的生防资源和开发利用生防菌株具有指导意义.     

不同寄主来源腐烂病菌对枣树致病性研究

[目的]明确枣树腐烂病菌来源,为生产综合防治提供理论依据.[方法]将不同寄主来源腐烂病菌分别接种于30;枣树树皮培养基、果实、枝条和田间接种枝条,观察并计算发病率、病斑扩展速度及产孢情况.[结果]在30;枣树树皮培养基上,不同寄主来源腐烂病菌均能在7d内产孢,来源于柳树、苹果、沙枣、枣树腐烂病菌在30 d内先后产生橘黄色分生孢子角;来源于沙枣、枣树、胡杨及杨树腐烂病菌均能在枣果上产孢,来源于苹果和梨树腐烂病菌未在果实上形成产孢体;不同寄主来源腐烂病菌均能在枣树离体枝条上产孢并吐出分生孢子角,来源于桃树和沙枣树腐烂病菌在枝条上的侵染速度最快.田间枝条接种测定中来源于胡杨腐烂病菌病斑扩展速度最快,接种胡杨和梨树腐烂病菌的枝条在15 d内产生小黑点并吐出黄色分生孢子角.[结论]不同寄主来源腐烂病菌均能在30;枣树树皮培养基繁殖并能形成产孢体,并能产生分生孢子角;均能侵染枣树离体组织和田间健康枝条,但不同寄主来源腐烂病菌致病性存在明显差异.     

甘肃省苹果树腐烂病菌ITS序列分析及潜育期研究

为了明确甘肃省苹果树腐烂病菌的种类及其优势种的潜育期,通过ITS序列比对和离体枝条接种法对采自甘肃省不同地区的苹果树腐烂病菌进行了ITS序列测定、分析及潜育期研究.结果表明:甘肃省苹果树腐烂病菌有2个种,分别为Valsa mali和Valsa malicola,其中Valsa mali有2个变种,分别为Valsa mali var.mali和Valsa mali var.pyri.甘肃省苹果树腐烂病菌优势种Valsa mali的潜育期随保湿时间增加而缩短,保湿时间为72h时潜育期为74.3h;温度30℃时潜育期最短,为64.3h;潜育期随枝龄的增加而增加,嫩梢的潜育期为46.3h;光暗交替下潜育期最短,为45.3h.     

影响苹果树腐烂病菌侵染致病的流行因子

[目的]腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树.论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据.[方法]通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖...     

产黄青霉菌及其代谢产物对苹果树腐烂病的诱导抗性研究

为了诱导树体产生较强的抗性,将产黄青霉菌通过PA培养繁殖后,连同其产生代谢物液体作为生物药液处理苹果树刮皮后的伤口,不同时间段测定树体的酶活性,结果表明,树体PAL的活性、PPO的活性、POD的活性和木质素的含量都有一定的提升,特别是培养4～6d的产黄青霉菌及代谢物,诱导产生抗性物质的作用最为理想和显著.     

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础。【方法】以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析。【结果】采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17cm pH 4.0~7.0IPG胶条,对苹果树腐烂病菌菌丝蛋白进行双向电泳可以得到理想的蛋白图谱。利用该体系对苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其致病力丧失突变体菌株X900的菌丝总蛋白进行双向电泳分析发现,2个菌株共存在27个差异表达蛋白点,其中有15个显著差异表达蛋白点;质谱分析结果表明,突变体X900中缺失的2个蛋白点4633和8518分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和假想蛋白,其他13个显著差异表达蛋白点分别为1个微管蛋白、1个线粒体内膜转移酶亚基、1个丙酮酸脱羧氧化酶、1个腺苷高半胱氨酸激酶、2个压力诱导的磷蛋白、1个己糖磷酸肌醇激酶、1个热激蛋白和5个假想蛋白。GO分析表明,该差异蛋白主要参与能量代谢、胁迫应答、细胞结构组成和未知功能。【结论】建立了适合苹果树腐烂病菌菌丝蛋白的双向电泳体系,并通过该体系分析获得了不同致病力材料的一系列差异表达蛋白。     

库尔勒香梨树腐烂病菌生物学特性与致病性的初步研究

【目的】测定库尔勒香梨树腐烂病菌子实体形态特征、培养性状观察和致病性,了解其生物学特性和致病性,为该病防治策略制定提供参考依据。【方法】挑取病样子实体进行切片观察;在不同环境条件下进行培养性状观察;将病菌分别接种于杨树(Populus bolleana Lauche)、沙枣(Elaeagnus angustifolia L.)、梨树(Pyrus sorotina)、柳树(Salixmatsudana Koidz)、核桃(J.regia L.)、苹果(M.pumila Mill.)、红枣(Ziziphuszizyphus)的枝条和叶片上,观察并统计发病率、病斑扩展速率。【结果】病菌分生孢子器具有多腔室,分生孢子呈腊肠形;病菌最适生长温区为20~30℃,最适p H值为6,全光照条件下产孢最多。在核桃树叶片上病斑扩展速度最快,在柳树上最慢;能在苹果和胡杨枝条形成产孢体并吐出黄色或橘黄色分生孢子角。【结论】分离后腐烂病病原菌经形态特征观察鉴定为梨幹腐烂壳蕉孢菌(C.carphosperma Fr.),病原菌在不同培养环境条件下颜色、生长速度、表面形态、菌落形状、色素分泌均存在明显的差异性;腐烂病病源菌能可使7种不同寄主感病,但在病斑扩展和产孢能力等方面存在明显差异,腐烂病病原菌对不同寄主的致病性存在一定差异。     

修剪工具对苹果树腐烂病菌的传播作用

为明确修剪工具能否传播苹果树腐烂病菌以及不同的修剪时间对苹果树腐烂病菌传播和侵染的影响,2011—2013年连续2个年度进行不同时间分别用带菌和不带菌修剪工具进行剪枝的试验。结果表明,带有腐烂病菌的修剪工具能够在修剪过程中传播苹果树腐烂病,并且与12月、1月、2月相比,选择在3月份进行集中修剪,发病率最低。     

5种杀菌剂对苹果树腐烂病菌的抑制作用

在室内离体条件下,测定了400 g/L 氟硅唑乳油、43%戊唑醇悬浮剂、25%吡唑嘧菌酯乳油、20%丁香菌酯悬浮剂及1.6%噻霉酮水剂对苹果树腐烂病的毒力.结果表明:5种杀菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中400 g/L 氟硅唑乳油、43%戊唑醇悬浮剂、25%吡唑嘧菌酯乳油的抑菌效果较好, EC50分别为0.01511μg/mL、0.03183μg/mL、0.09088μg/mL,而常用药剂20%丁香菌酯悬浮剂和1.6%噻霉酮水剂的抑菌效果相对较弱, EC50分别为17.35152μg/mL 和1.99169μg/mL     

苹果树腐烂病菌分隔蛋白基因VmImp2的功能研究

旨在研究苹果树腐烂病菌(Valsamali) VmImp2基因的功能,以期揭示腐烂病菌的生长发育及致病机理。利用生物信息学软件对 VmImp2进行蛋白序列及进化分析;利用Double-joint PCR和PEG介导原生质转化的方法,获得腐烂病菌 VmImp2的缺失突变体和回补菌株;利用十字交叉法以及伤口接种法,研究 VmImp2对病菌营养生长,繁殖体产生以及致病力的影响。生物信息学分析显示, VmImp2编码1 487个氨基酸,编码蛋白属于PCH(Pombe Cdc15 homology)家族,含有典型的FCH(Fes/CIP homology, F-BAR)和SH3(Src Homology 3)结构域,与梨树腐烂病菌(V.pyri)的Imp2蛋白亲缘最近。对基因进行敲除后,共获得5个缺失突变体菌株。表型分析显示,缺失突变体的营养生长受到明显影响,表现为菌丝更加稀疏,生长速率明显减缓。同时,突变体的繁殖体产生能力以及对枝条的侵染能力基本丧失。5个突变体的表型一致。将基因回补之后,共获得3个回补菌株,突变体表型缺陷基本恢复到野生型水平。说明 VmImp2基因参与苹果树腐烂病菌的营养生长、繁殖体形成以及致病过程。