水稻高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建及OsRPK1胞内互作蛋白质的筛选

为了挖掘水稻OsRPK1胞内互作蛋白质,阐明OsRPK1参与高盐胁迫的分子机制,本研究利用SMART技术,构建水稻高盐胁迫下根尖的酵母双杂交文库。PCR扩增获得OsRPK1基因编码胞内区域的碱基序列,构建诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),检测诱饵表达载体在酵母中的毒性和自激活活性,筛选OsRPK1胞内互作蛋白,进一步分析高盐胁迫下候选基因的表达模式。结果表明,构建的cDNA文库库容量为1.11×10~7 CFU,文库重组率为96%,文库插入片段多态性较好。成功构建了诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),经检测诱饵表达载体无毒性,无自激活活性。诱饵表达载体与cDNA文库进行双杂交筛选,经测序和比对分析获得了11个重要的候选基因,检测候选基因在高盐处理下的表达情况,其中8个候选基因受高盐诱导表达,2个候选基因受高盐胁迫抑制表达,1个候选基因受高盐胁迫瞬时诱导表达后表达量又受到显著抑制。     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选与绵羊微管解聚蛋白相互作用的蛋白

采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体p GBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒p GBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示：成功构建重组诱饵质粒p GBKT7–STMN1,并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用,且能在酵母细胞中正常表达;筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆,经测序比对分析和点对点验证,得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白,这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

广藿香醇合酶 PcPTS 互作蛋白的筛选与鉴定分析

【目的】广藿香〔Pogostemon cablin（Blanco）Benth.〕是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶（Patchouli alcohol synthase,PcPTS）在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白互作层面调控广藿香醇合成的机制尚不清楚。旨在筛选 PcPTS 的互作蛋白,以揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的调控机制和功能。【方法】利用酵母双杂交技术和 GST pull-down 联合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术筛选可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用 MASCOT 软件和 BLAST 分析注释互作蛋白,选取有文献报道参与其他蛋白互作、影响蛋白转运、修饰或降解、参与次生代谢调控的蛋白,利用酵母双杂交技术初步验证它们与 PcPTS 蛋白的互作关系并对互作蛋白进行生物信息学分析。【结果】通过 PCR 技术成功克隆了 PcPTS 的 cDNA 序列,开放阅读框（ORF）为 1 659 bp,编码 522 个氨基酸。构建了广藿香 cDNA 初级文库和酵母杂交文库,初级和次级文库容量分别为 7.6×106 CFU 和 8.6×106 CFU,初级和次级文库的重组率均为 100%,且插入片段平均长度均大于 800 bp。构建的诱饵载体 pGBKT7-PcPTS 对酵母菌株不产生毒性,且无自激活活性。利用酵母双杂交筛选得到阳性克隆并进行测序和 BLAST 分析,获得 17 个候选蛋白。成功构建了 GST-PcPTS 表达载体,诱导表达纯化获得 GST-PcPTS 诱饵蛋白,利用诱饵蛋白从广藿香总蛋白中捕获互作蛋白,共鉴定出 98 个候选互作蛋白。从候选蛋白中筛选 14 个可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用酵母双杂交进行点对点验证,结果发现PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD 与 PcPTS 存在相互作用。生物信息分析表明,四者分别属于 CCCH 锌指蛋白家族、烯醇化酶蛋白、ACR 亚家族和 HAD-like 超家族。【结论】初步筛选验证获得与 PcPTS 存在相互作用的 4个蛋白 PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD,有助于揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的作用机制,也为进一步研究广藿香醇的合成调控机制奠定了坚实基础。     

酵母穿梭表达质粒pGBKT7-hCK2α＇的构建

目的：用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法；通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA，将PstⅠ／NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7，转化感受态细胞DH5α获得转化子．琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109．Westernblot签定hCK2α’蛋白表达．检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果：限制性酶切结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白，pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论：pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功，可应用于酵母双杂交体系。