钙调蛋白(CaM)对附植前小鼠胚胎热休克蛋白70(HSP70)表达的影响

体外培养的奶牛,绵羊和小鼠的附植前胚胎在热应激条件下能够合成热休克蛋白70以增强胚胎的耐热性保护其不受热损伤.而钙调蛋白(CaM)是细胞内最重要的Ca2+受体蛋白并参与细胞活动中重要基因的转录活动.本实验旨在研究CaM参与小鼠(Mus musculus)胚胎热应激诱导型热休克蛋白70(HSP70)的表达,且明确CaM参与HSP70表达的具体途径.将发育至早期囊胚的胚胎分成空白对照(37℃)组、W7处理非热应激(37℃+W7)组、热应激(39℃)组和W7处理热应激(39℃+W7)组.提取总RNA并分别检测HSP70、CaM和热休克转录因子1(HSFl) mRNA表达;提取胞浆蛋白用Western blot技术检测HSP70、CaM和HSF1表达;用免疫共沉淀法检测HSP70-CaM和HSP70-HSF1复合物.结果发现,W7能显著抑制39℃热应激1h小鼠胚胎HSP70 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05); W7对其他各组胚胎HSF1mRNA表达的影响不显著(P＞0.05),但能显著降低39℃热应激1h小鼠胚胎HSF1蛋白表达(P＜0.05); 39℃热应激时,胚胎HSP70-CaM复合物增多,HSP70-HSF1复合物减少.本研究表明,小鼠胚胎受热应激时,CaM通过与HSP70竞争性结合,解离出HSF1,从而使HSP70大量表达.本研究揭示了CaM参与小鼠胚胎热激反应中HSP70表达的一种途径.可为研究胚胎耐热性以及热激信号转导提供基础资料.     

莲草直胸跳甲Hsp70基因克隆及高温表达分析

为揭示热激蛋白(heat shock proteins,Hsps)基因和莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila温度胁迫适应性的关系,克隆了莲草直胸跳甲Hsp70基因序列,采用实时荧光定量PCR的方法检测了25~42.5℃莲草直胸跳甲成虫体内Hsp70的表达情况。结果表明:所克隆序列含有Hsp70家族的典型基序和位点,并与其它昆虫Hsp70的序列相似性很高,其中与马铃薯甲虫的相似性达到94%,表明所克隆序列为Hsp70靶基因,并对序列进行了系统进化分析;莲草直胸跳甲Hsp70的诱导起始温度为32.5℃(Ton),诱导最高温度为37.5℃(Tmax);Hsp70的Tmax能代表莲草直胸跳甲的耐受极限温度,是揭示物种耐受性的很好指标。本研究结果表明Hsp70在莲草直胸跳甲的高温适应性中可能起重要作用。     

高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同时间高温(42℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响.结果发现,热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调,其中hsp70转录水平有急剧上调过程,且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势;标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调,随后升高;但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调;在检测的热处理过程中,αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降,而β-酪蛋(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调;与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体.-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调,而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化.本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应,对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响,细胞产生热耐受.     

灯盏花乙素(Scu)对猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞热休克蛋白72(HSP72)及凋亡相关基因表达的影响

灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。     

钙对苹果果实钙调蛋白含量和Ca2+ -ATPase活性及其基因表达的影响

研究不同浓度钙（0、1和10 mmo1/L CaCl2 ;5 mmo1/L EGTA）对苹果果实钙调蛋白（CaM）含量和Ca2+-ATPase活性及其基因表达的影响。利用同源克隆方法分离CaM和Ca2+-ATPase基因,采用荧光定量PCR方法研究它们表达特征。结果表明,果实切片外源补钙,可溶性Ca2+及CaM含量在高钙处理12 h达到高峰;高钙处理12 h质膜Ca2+-ATPase活性显著增加,与胞内CaM含量增加时间一致;高钙处理24 h液泡膜Ca2+-ATPase活性显著增加;随着质膜和液泡膜Ca2+-ATPase活性显著增加,可溶性Ca2+含量在加钙处理48 h显著下降。研究基因表达发现,加钙处理6 h苹果CaM基因的表达量显著增加;加钙处理12 h苹果Ca2+-ATPase基因的表达量显著增加,与CaM含量及质膜Ca2 +-ATPase活性变化一致。果实缺钙处理显著增加CaM基因表达量,而苹果Ca2 +-ATPase基因的表达量没有显著变化。上述研究表明,苹果补钙可以提高细胞内可溶性Ca2+和CaM含量以及CaM基因的表达量,有效启动钙信使系统;质膜及液泡膜Ca2+-ATPase是调控胞内Ca2+关键的酶,通过提高质膜及液泡膜Ca2+-ATPase的活性及Ca2+-ATPase基因的表达量,维持胞内Ca2+的稳态水平。     

番茄Hsp70基因鉴定及系统发育关系分析

热激蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是植物应对高温和其他胁迫环境时所产生的一类特定的应激蛋白。本文以番茄基因组数据为基础,利用生物信息学方法对Hsp70基因家族进行鉴定与分析。结果表明,番茄至少含有22个Hsp70基因成员,蛋白质序列长度为210-890个氨基酸之间,具有0~12个内含子;具有4对重复基因;滑动窗口分析结果表明,这些基因中的一些区段(或者位点)可能受到正选择的压力。此外,序列比对发现这些Hsp70基因家族成员具有多个保守基序;染色体定位发现他们不均匀分布在番茄的11条染色体上;系统发育关系揭示番茄和拟南芥Hsp70基因家族成员可以分为4组,每组成员数目是变异的,并且存在3对旁系同源基因和7对直系同源基因,表明Hsp70基因家族在番茄和拟南芥分化之前就已经存在。     

肉鸡热休克蛋白70 mRNA荧光定量PCR方法的建立和优化

对适应性饲养到30日龄时的60只肉鸡进行热应激处理,通过热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)mRNA荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)方法检测热应激处理肉鸡组织中HSP70mRNA含量。虽然受试鸡肝脏和心脏的HSP70mRNA水平在热应激6h时略低于对照组(P>0.05),但随持续性高温应激时间的延长,HSP70mRNA水平逐渐升高,热应激18h时应激肉鸡肝脏和心脏HSP70mRNA水平达最高水平,明显高于对照组(P<0.01)。实验选用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为内参照,体外转录的RNA和阳性质粒作为两种标准品。结果显示,实验所建立和优化的FQ-PCR反应体系是理想的。     

水稻干尖线虫Hsp90基因克隆及在不同逆境、侵染早期和取食过程的表达差异

热激蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)调控生物体的细胞代谢、生长发育和逆境适应等一系列生物过程.本研究通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)分离获得了一个水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)Hsp90基因,命名为Ab-hsp90.Ab-hsp90全长cDNA序列含有69bp的5’非翻译区、编码712个氨基酸2 139 bp的开放阅读框以及137 bp的3'非翻译区UTR.Ab-hsp90DNA序列包含9个外显子和8个内含子.Ab-hsp90蛋白序列与其他植物寄生线虫Hsp90s高度相似,最大似然树显示与植物寄生线虫位于同一进化分支;结构上具有5个保守的Hps90蛋白家族序列标签和特异MEEVD基系,表明Ab-hsp90为胞质型Hsp90.qRT-PCR显示,Ab-hsp90在水稻干尖线虫各个龄期均表达,在卵和成虫表达水平最高.当线虫暴露于干燥、低渗透胁迫以及短时间阿维菌素溶液中时Ab-hsp90均上调表达;Ab-hsp90还受到短时低温(4℃)诱导,在高温(40℃)环境持续高水平表达.在侵染抗感不同的水稻(Oryza sativa)植株时,Ab-hsp90的表达水平具有差异性:在线虫接种抗性水稻72 h内,Ab-hsp90一直高度表达,而在接种感病水稻上Ab-hsp90表达水平显著升高随后下降.取食灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的线虫Ab-hsp90在9d内始终高度表达,而胡萝卜(Daucus carota)愈伤组织培养的线虫6d内Ab-hsp90表达上调但此后逐渐下调.这些数据表明,Ab-hsp90可能参与水稻干尖线虫的抗逆适应、早期侵染以及取食行为.本研究有助于拓展植物寄生线虫Hsp90蛋白的功能,为进一步研究线虫与植物互作机制提供了有益借鉴.     

高温强光下Ca2+对西葫芦幼苗膜质过氧化、抗氧化酶系统及热耗散的影响

为探明不同浓度外源Ca2+对高温强光胁迫下西葫芦植株幼苗的影响,本试验选用西葫芦(Cucurbitapepo L.)品种"阿兰一代"为试验材料,通过外源喷施不同浓度CaCl2溶液,研究了Ca2+对高温强光胁迫下西葫芦幼苗叶绿素荧光特性、膜质过氧化及抗氧化酶系统的影响。结果表明,较低浓度Ca2+处理(5~20 mmol.L 1)可有效提高高温强光下西葫芦幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(O2&)含量和膜透性,还原型谷胱甘肽(GSH)含量升高;同时西葫芦叶片PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)和光化学猝灭系数(qP)较高,而非光化学猝灭系数(NPQ)较低。说明5~20 mmol.L 1Ca2+处理对高温强光胁迫具有明显的缓解作用,同时其热耗散较小。当Ca2+处理浓度超过40 mmol.L 1时对高温强光胁迫缓解效应不明显。     

Ca2+和CaM对苹果果实Ca2+-ATPase,SOD和PEA活性的影响

采用45Ca2+ 示踪等方法研究苹果果肉质膜微囊Ca2+ ATPase与Ca2+ 运输之间的关系 ,在Ca2+ 和CaM激活剂和抑制剂存在条件下培养果实圆片 ,探索Ca2+-ATPase ,SOD和PEA活性受Ca2+和 (或 )CaM调控的可能性。结果表明 ,存在于质膜上的Ca2+-ATPase并受载体A23187刺激而活性增加 ,Ca2+-ATPase活性与Ca2+运输依抑制剂EB浓度增加而下降 ,二者变化趋势十分一致 ,从而证实了Ca2+-ATPase推动苹果果肉质膜微囊Ca2+的主动运输。果肉质膜微囊Ca2+-ATPase同时受到Ca2+和CaM调节 ,而SOD和PEA活性仅受Ca2+ 的调节 ,而与CaM无关。     

绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)cDNA克隆与组织表达分析

热休克蛋白(HSP)与生物机体的耐热性能相关。为研究不同热应激模式下与热应激恢复过程绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)mRNA在不同组织中表达差异,阐明HSP90基因的热应激保护的分子机理。本研究采用RT-PCR方法从绍兴鸭(Anas platyrhynchos)肝脏组织中克隆HSP90 cDNA序列(GenBank登陆号:JQ837244),编码区序列长度为2211bp,编码736个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,绍兴鸭与家禽(北京鸭、火鸡、鸡、日本鹌鹑)和哺乳动物(大猩猩、人、牛、灰狼等)的基因序列分别有92.6%～99%和80%～88%的同源性;荧光定量PCR结果发现,30℃长期应激能显著提高绍兴鸭垂体中HSP90 mRNA表达量;35℃长期应激能显著提高心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平;40℃急性热应激时,心脏、肝脏、肾脏、垂体和胰腺中的HSP90 mRNA表达量达到最高值。恢复性实验表明,热应激恢复1h肝脏和心脏中HSP90 mRNA表达水平最高,均于3h降低到应激前水平。心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平与热应激强度显著相关。本研究为以HSP90 mRNA表达水平为衡量指标进行绍兴鸭热应激预防与控制提供资料。     

玉米Ubi-1启动子驱动挪威鼠热激蛋白4基因（Hspa4）植物表达载体的构建

挪威鼠热激70 kD蛋白4(Rattus norvegicus heat shock protein 4,Hspa4)是哺乳动物细胞内重要的一种分子伴侣,通过参与热激响应、未折叠蛋白应答等来保护机体免受损伤,在适应外界应答时是一种关键性的蛋白质(Kang et al.,2002;Zhao et al.,2007),有阻止蛋白质变性的功能.本研究选用在单子叶植物中活性极强的玉米Ubi-1启动子,构建了可持续、高效表达挪威鼠Hspa4基因的组成型单子叶植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4(p13UH),为利用Hspa4提高植物的抗逆性提供资料.     

PCAM蛋白功能分析及其与油菜素内酯(BR)信号转导关系

为阐明油菜素内酯(BR)和Ca2+信号转导的关系及其在调控植物生长发育过程中的作用机理,本研究利用2D-DIGE技术结合质谱分析在水稻(Oryza sativa L.ssp.Japanica)BR不敏感突变体(d61-4)和BR合成突变体(brd1-3)中鉴定到一个与野生型水稻相比明显上调的蛋白质,通过质谱鉴定,此蛋白为一Ca2+信号转导相关蛋白(putative calmodulin,PCAM);在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达PCAM后转基因株系表现为生长缓慢,植株矮小,整个植株的生长周期明显延长。在过表达PCAM转基因株系中BR信号转导关键基因SaurAC被明显下调。研究结果表明,PCAM参与到BR信号转导途径过程中,在BR调控的植物生长发育过程中起负调节作用,过表达PCAM的转基因植株是抑制BR生理作用的表型。     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701基因的克隆及高温胁迫下的表达分析

为探讨热激蛋白Hsp70基因在高温胁迫下的响应机制及其分子机理,分析Hsp70基因与叶用莴苣耐热性的关系,本研究通过同源克隆及RACE技术,克隆了叶用莴苣热激蛋白Ls Hsp70-3701基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在叶用莴苣热敏品种P-S11和耐热品种G-S59中高温胁迫下的表达差异。该基因c DNA全长为2 191 bp,开放阅读框为1 950 bp,编码649个氨基酸,具有Hsp70家族特有的标签序列,与拟南芥、番茄、小麦等物种的Hsp70同源性达到90%以上。qRT-PCR分析显示,高温胁迫下该基因在2个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平显著高于热敏品种,且在42℃高温下热敏品种P-S11中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种G-S59中则能长时间保持较高的表达水平。结果表明,Ls Hsp70-3701基因可能与叶用莴苣耐热性相关。本研究为有效解决叶用莴苣高温抽薹问题提供了数据支持。     

牙鲆胚胎低温处理下内参基因筛选及CIRP和Hsp70基因表达分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国主要的海水经济养殖鱼类,在胚胎冷冻保存方面已获得了超低温冷冻保存成功的案例,但在分子水平上对牙鲆胚胎在低温状态下相关基因的表达进行研究,至今还未见报导。本研究首先收集了牙鲆的3个胚胎时期(肌节期、尾芽期和心跳期),分别在0℃及16.5℃进行处理培养,使用实时荧光定量PCR技术检测4个内参基因18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α的表达水平,并用Ge Norm和Norm Finder软件对其的稳定性进行排序分析。Ge Norm软件分析结果显示,18S rRNA和EF1α的稳定性最好,稳定性最差的为GAPDH;Norm Finder软件分析结果显示,18S rRNA的稳定性最好。综合两个软件的分析结果,在不同发育时期以及低温处理的牙鲆胚胎中,18S rRNA表达量相对稳定,较其他3个基因更适合作为内参基因。为探究牙鲆胚胎在低温处理下分子水平的变化,本研究选取了对温度适应性较强的尾芽期胚胎为实验材料,分别在低温0℃和正常培养温度16.5℃下进行培养,并选取与应激反应相关的热休克蛋白基因(heat shock protein,Hsp)70和冷诱导RNA结合蛋白基因(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)进行表达量分析。实时荧光定量PCR的结果表明,CIRP的表达量在0℃处理30 min之内逐渐下降,在30 min时达到最低值,30~120 min内上升,并在120 min时达到峰值,之后回落,在180 min时,其表达量回落到与对照组相似的水平。而Hsp70在低温处理的前30分钟表达量下降,后回升,120 min达到最大值后回落的现象,与对照组有显著性差异(P0.05)。研究结果说明低温会导致CIRP及Hsp70基因表达水平的改变,先下降后升高再回落的趋势也说明了机体内对低温应激产生了保护反应,为探索牙鲆胚胎在低温下调节和适应的分子机理提供了一定的依据。     

植物寄生线虫Hsp70研究进展

热激蛋白70（heatshockprotein70,Hsp70）是所有原核生物和真核生物在发育过程中为了适应不同环境而合成并起关键作用的蛋白质家族。多种植物寄生线虫编码的Hsp70基因序列己被克隆和检测,但其在应激反应中线虫与寄主植物的互作机制仍不是很清楚。本文对Hsp70家族的分类、Hsp70结构及其生物学功能进行了综述,从Hsp70基因的克隆、表达和系统进化介绍了植物寄生线虫Hsp70基因的研究进展,并就今后植物寄生线虫Hsp70的相关应用基础研究进行了展望。