黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

灯盏花乙素(Scu)对猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞热休克蛋白72(HSP72)及凋亡相关基因表达的影响

灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。     

诱导表达猪生长激素pGH载体系统构建及其在PK15细胞中表达验证

为实现外源生长激素(GH)基因在特定时间、空间的可控表达,本研究构建四环素(TET-ON)表达载体系统,并在细胞水平对该载体系统进行诱导活性验证。结果表明:(1)成功构建了重组载体pTRE-GH12;(2)筛选建立了可诱导表达GH的细胞系;(3)利用强力霉素(doxycycline,DOX)诱导阳性细胞克隆并检测外源GH的表达,QRT-PCR结果表明,实验组细胞在DOX诱导后表达活性是诱导前264.481倍;对照组细胞在DOX诱导前诱导后表达无明显变化,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后差异极显著(P<0.01);(4)Western杂交后灰度分析结果和QRT-PCR趋势一致,实验组和对照组细胞间GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,四环素(TET-ON)诱导猪生长激素(GH)表达系统实现了可控表达,为以后制备可诱导表达GH的转基因动物提供了技术基础。     

钙调蛋白(CaM)对附植前小鼠胚胎热休克蛋白70(HSP70)表达的影响

体外培养的奶牛,绵羊和小鼠的附植前胚胎在热应激条件下能够合成热休克蛋白70以增强胚胎的耐热性保护其不受热损伤.而钙调蛋白(CaM)是细胞内最重要的Ca2+受体蛋白并参与细胞活动中重要基因的转录活动.本实验旨在研究CaM参与小鼠(Mus musculus)胚胎热应激诱导型热休克蛋白70(HSP70)的表达,且明确CaM参与HSP70表达的具体途径.将发育至早期囊胚的胚胎分成空白对照(37℃)组、W7处理非热应激(37℃+W7)组、热应激(39℃)组和W7处理热应激(39℃+W7)组.提取总RNA并分别检测HSP70、CaM和热休克转录因子1(HSFl) mRNA表达;提取胞浆蛋白用Western blot技术检测HSP70、CaM和HSF1表达;用免疫共沉淀法检测HSP70-CaM和HSP70-HSF1复合物.结果发现,W7能显著抑制39℃热应激1h小鼠胚胎HSP70 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05); W7对其他各组胚胎HSF1mRNA表达的影响不显著(P＞0.05),但能显著降低39℃热应激1h小鼠胚胎HSF1蛋白表达(P＜0.05); 39℃热应激时,胚胎HSP70-CaM复合物增多,HSP70-HSF1复合物减少.本研究表明,小鼠胚胎受热应激时,CaM通过与HSP70竞争性结合,解离出HSF1,从而使HSP70大量表达.本研究揭示了CaM参与小鼠胚胎热激反应中HSP70表达的一种途径.可为研究胚胎耐热性以及热激信号转导提供基础资料.     

鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性

熊果酸(ursolic acid,UA)是枇杷(Eriobotrya japonica L.)中重要的生物活性成份,鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)是UA等五环三帖生物合成途径中的限速酶之一。为了克隆SQEs基因,寻找枇杷细胞悬浮培养获取UA合适的胁迫温度,建立此胁迫温度下SQEs的差异表达及其与UA含量的联系,本研究以枇杷悬浮培养细胞为材料,在对数生长期中后期设置低温15℃和高温35℃处理,研究收获时(12 d)细胞生长与目标产物UA的相互关系。同时,采用同源克隆方法分离SQEs,研究15℃处理中,两个枇杷鲨烯环氧酶基因(ej SQE1和ej SQE2)的差异性表达。结果表明,ej SQE1(Gen Bank登录号:JQ294053.2)与ej SQE2(Gen Bank登录号:JQ294054.2)氨基酸序列的相似度为69.89%,序列的两末端差异最大;15℃下,距离收获48 h的处理中UA总含量最高;ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。15℃下,距离收获24 h的处理,两者表达量显著下降(P<0.05);距离收获长于24 h的处理,枇杷悬浮细胞中ej SQE1和ej SQE2两个基因的表达量之和以及ej SQE2基因与UA的含量呈现出显著正相关(P<0.05)。本研究获得了SQEs基因序列及胁迫温度下的表达特征,为枇杷细胞悬浮培养UA调控机制的研究提供基因源及参考资料。     

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在不同年龄公猪睾丸中的表达

采用免疫组化（immunohistochemistry）和半定量RT-PCR法研究了胶质细胞源性神经营养因子（Glial cellline-derivedneurotrophic factor,GDNF）在生后仔猪睾丸中的表达,探讨了GDNF在睾丸发育和精子发生中的作用.实验结果发现,在幼龄阶段（2～4周龄）,GDNF蛋白主要表达于间质细胞区,而在曲细精管内未见表达.从第2月龄开始,GDNF蛋白在曲细精管内的支持细胞胞浆出现阳性信号,呈较低水平表达.随着年龄的进一步增长,GDNF在睾丸曲细精管内的表达不断增强,到成年时GDNF蛋白表达水平达最高.RT-PCR结果显示,仔猪出生后2周,睾丸中即存在GDNFmRNA的表达,随着年龄的增加,GDNFmRNA水平持续升高,到2月龄和6、18月龄分别与出生2周时有显著性（P＜0.05）和极显著性（P＜0.01）差异,其中第6月龄达高峰.实验结果表明GDNF可能直接参与了出生后仔猪睾丸的发育,并在调节精子发生中起着重要的作用.     

脱氢表雄酮(DHEA)对鸡胚原代肝细胞cAMP/PKA信号通路和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的影响与调节

控制肉鸡脂肪过多沉积是肉鸡生产中亟待解决的问题。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是人体分泌最为丰富的肾上腺类固醇激素,可经由类固醇激素受体介导发挥生理功能,降低机体生脂能力。本研究以鸡胚原代肝细胞为研究对象,选用含DHEA终浓度为0(对照)、0.01、0.1、1.0、10和100μmol/L的培养液孵育肝细胞20min后收集细胞,放射免疫测定法(RIA)检测胞内cAMP水平。结果发现,0.1～100μmol/L DHEA孵育肝细胞均可显著提高胞内cAMP水平(P<0.05),其中0.1μmol/L DHEA效果最为显著(P<0.01)。0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min或1h后收集细胞,RIA法分别检测胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性,(γ-32P)ATP掺入法测定cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,Western blot法测定cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平。结果显示,0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min可显著降低胞内PDE活性(P<0.05),提高PKA活性(P<0.05),但对AC活性无显著性影响(P>0.05)。0.1μmol/L DHEA处理肝细胞1h可显著提高CREB蛋白磷酸化水平(P<0.05),且这种效应可被PKA抑制剂阻断(P>0.05)。本研究结果提示,DHEA调控肉鸡肝脏脂肪代谢,降低脂肪沉积的机制可能与激活胞内cAMP/PKA信号系统,活化转录因子CREB有关。     

干扰水稻瘤矮病毒(RGDV)非结构蛋白(Pns12)的表达抑制病毒在介体昆虫培养细胞内的复制

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播,其基因组第12条片段编码的非结构蛋白(nonstructural protein,Pns12)是提供病毒复制和子代病毒粒体装配场所——病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确Pns12在RGDV侵染介体电光叶蝉培养细胞中的功能,本研究通过原核表达的Pns12蛋白免疫注射兔(Oryctolagus cuniculus),制备Pns12抗体,并应用免疫荧光标记和RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究Pns12在介体培养细胞内的定位和参与病毒原质形成的过程。共聚焦显微镜观察到,病毒侵染的细胞中,与荧光素交联的Pns12抗体特异地标记在病毒原质上。干扰Pns12蛋白表达后,可有效地阻碍病毒原质的形成、子代病毒粒体的组装和病毒非结构蛋白Pns12和外壳蛋白P8蛋白的表达,表明Pns12作为病毒原质的组分参与了RGDV在介体培养细胞内的复制。也表明,Pns12可作为理想的靶标用于阻断电光叶蝉携带和传播RGDV。     

翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)与细胞生长调控

翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一个在物种间高度保守、广谱表达和多功能的蛋白质,具有调节细胞骨架的动态变化和调节细胞的生长与增殖的作用；能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录；调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应和保护细胞免受多种应激的损伤等.本文综述了TCTP的结构、表达调控、生物学功能等研究进展.     

雷帕霉素在卡介苗(BCG)感染小鼠RAW264.7细胞过程中对NO的调控作用

巨噬细胞产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)在抵御及杀灭病原微生物过程中起重要作用。为了解哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染宿主巨噬细胞过程中对NO的调控作用,本研究在卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染体外培养的BALB/c小鼠(Mus musculus)巨噬细胞系RAW264.7过程中添加mTOR信号通路的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin),通过Griess、实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测NO及诱导性一氧化氮合成酶基因(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA及其蛋白的表达情况,同时以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)处理的RAW264.7细胞作为参照。结果表明,与未经处理的空白对照组相比,BCG、LPS刺激6、12和24 h可以极显著增加RAW264.7细胞中NO的产生(P0.01),iNOS mRNA及其蛋白水平表达极显著增加(P0.01)。与未添加rapamycin组相比,BCG感染6和12 h时,10 nmol/L rapamycin可以极显著抑制RAW264.7细胞中NO的产生及iNOS的表达(P0.01),但24 h时rapamycin对产生NO的抑制作用不显著(P0.05),但同样可以极显著抑制iNOS的表达(P0.01);LPS刺激6和24 h时,10 nmol/Lrapamycin可以极显著抑制RAW264.7细胞中NO的产生(P0.01);12 h时,显著抑制NO的产生(P0.05);LPS刺激时,6 h时rapamycin对iNOS的表达的抑制作用不显著(P0.05),12和24 h时极显著抑制iNOS的表达(P0.01)。结果显示,rapamycin在MTB感染宿主巨噬细胞过程中对NO的产生有重要的调控作用,为揭示mTOR信号通路在结核病发生及发展过程中的作用提供重要的理论依据。     

绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)cDNA克隆与组织表达分析

热休克蛋白(HSP)与生物机体的耐热性能相关。为研究不同热应激模式下与热应激恢复过程绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)mRNA在不同组织中表达差异,阐明HSP90基因的热应激保护的分子机理。本研究采用RT-PCR方法从绍兴鸭(Anas platyrhynchos)肝脏组织中克隆HSP90 cDNA序列(GenBank登陆号:JQ837244),编码区序列长度为2211bp,编码736个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,绍兴鸭与家禽(北京鸭、火鸡、鸡、日本鹌鹑)和哺乳动物(大猩猩、人、牛、灰狼等)的基因序列分别有92.6%～99%和80%～88%的同源性;荧光定量PCR结果发现,30℃长期应激能显著提高绍兴鸭垂体中HSP90 mRNA表达量;35℃长期应激能显著提高心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平;40℃急性热应激时,心脏、肝脏、肾脏、垂体和胰腺中的HSP90 mRNA表达量达到最高值。恢复性实验表明,热应激恢复1h肝脏和心脏中HSP90 mRNA表达水平最高,均于3h降低到应激前水平。心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平与热应激强度显著相关。本研究为以HSP90 mRNA表达水平为衡量指标进行绍兴鸭热应激预防与控制提供资料。     

苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)是防治苹果蠹蛾最重要的生物药剂之一,为探寻苹果CpGV GP37蛋白的增效机制,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将苹果CpGV gp37基因和绿色荧光蛋白基因(egfp)以N端或C端融合的方式插入苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid NPV,AcMNPV)基因组中,获得重组的杆状病毒质粒(bacmid),转染昆虫细胞Sf9,然后进行Western blot检测。结果显示,检测到GP37和EGFP的融合蛋白(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合蛋白(vAcGP37、vAcEGFP)都得到了高效表达;用激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况,融合GP37的EGFP主要聚集在细胞质中,没有融合GP37的EGFP遍布整个细胞,说明CpGV GP37蛋白定位于细胞质中。本实验研究了CpGV GP37蛋白的真核表达,为该蛋白的后续研究提供了条件;而该蛋白的亚细胞定位研究,不仅为CpGV GP37蛋白增效机制的研究提供了基础资料,同时丰富了杆状病毒GP37蛋白的相关理论。     

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与沉默信息调节因子1(Sirt1)抑制小鼠脂肪沉积

探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)对小鼠脂肪沉积的抑制作用和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。用Sirt1的激动剂白藜芦醇(100mg·kg-·1d-1)和抑制剂尼克酰胺(500mg·kg-·1d-1)灌胃处理小鼠(Mus mussulus)15d,记录小鼠体质量变化,测定小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肾周脂肪的沉积量,试剂盒测定血脂指标,同时利用Real-timePCR分析与脂肪生成密切相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和脂解基因甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、围脂滴蛋白(Perilipin)及生脂基因脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达水平,检测mTOR通路关键因子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)和真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)mRNA表达水平。与对照组相比,白藜芦醇处理组小鼠体质量增加量和体脂含量均显著降低(P<0.01),血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)浓度均显著降低(P<0.01),而高密度脂蛋白(HDL-C)浓度升高(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR、4EBP1和S6K1mRNA表达水平降低(P<0.01),脂代谢相关基因PPARγ、SREBP1及成脂基因FASmRNA表达水平显著降低(P<0.01),脂解相关基因ATGL、HSL和PerilipinmRNA表达水平显著升高(P<0.01);烟酰胺处理组小鼠体质量、附睾脂肪以与皮下脂肪沉积量增加缓慢(P>0.05),肾周脂肪沉积量增加(P<0.05),血清中LDL-C浓度升高(P<0.05),HDL-C浓度降低(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR和4EBP1mRNA表达水平升高(P<0.01),而脂代谢调控相关因子PPARγ和SREBP1mRNA水平升高(P<0.05),ATGLmRNA表达量显著降低(P<0.05),FAS、HSL和PerilipinmRNA表达量变化不显著(P>0.05)。表明激活Sirt1可减少脂肪合成,增加脂肪分解,从而降低体脂沉积,而mTOR信号通路参与这个过程。     

钙-钙调素信号通路调节热应激蛋白70表达的机制

随着温室效应的加剧,全球气候变暖已经成为现代畜牧业生产体系所面临的严峻挑战。高温炎热气候已成为影响畜禽生长繁殖的一种主要的非生物胁迫。热应激刺激时,动物体产生一系列生理变化来提高机体的耐受性,而本文旨在阐述钙(calcium,Ca2+)-钙调蛋白(calcium-activated calmodulin,Ca M)参与的耐热信号的转导机制,即热应激蛋白(heat shock proteins,Hsps)的表达机制。热应激时,细胞内Ca2+浓度上升,激活Ca M及其表达量的增加,随即Ca M作用于其下游的2种靶蛋白,即2条信号转导支路来提高热激转录因子1(heat shock factor 1,HSF1)的转录活性,进而调节热应激蛋白70(Hsp70)的表达。热应激时,Hsps表达的2条具体通路:1 Ca2+-Ca M激活下游的靶蛋白—钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ),Ca MKⅡ通过促进HSF1(230)的磷酸化来提高HSF1的转录活性,进而诱导Hsp70的表达;2 Ca2+-Ca M激活下游另一个靶蛋白Hsp70,Hsp70通过与增多的Ca M形成复合物,释放HSF1单体,增多的HSF1形成有活性的HSF1三聚体,并入核与热激元件(heat shock element,HSE)结合,使HSF1具有转录活性,进而诱导Hsp70的表达。本文系统完整地综述了Ca2+-Ca MHSF1-Hsp70热应激信号系统,在感受、传导和响应热应激刺激时的机制。     

稳定表达猪SARM1的MARC-145细胞系的建立

猪(Sus scrofa)SARM1基因是重要的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)候选基因,建立稳定表达SARM1的猴胚胎肾上皮细胞系(MARC-145)是进行SARM1功能研究的基础。本研究成功构建p EGFP-N1-p SARM1真核表达载体,并在MARC-145细胞中瞬时转染,结果显示,猪SARM1-GFP融合蛋白定位于MARC-145细胞的线粒体。使用浓度为800μg/m L的G418对转染p EGFP-N1-p SARM1的细胞进行加压筛选6 d,并进一步使用单克隆法筛选出稳转细胞系,结果显示,稳转细胞系形态正常,绿色荧光稳定表达。RT-PCR和Western blot检测结果均显示SARM1基因在稳转细胞系中稳定表达。应用q RT-PCR方法在PRRSV感稳转细胞系12 h后可以检测到PRRSV开放阅读框7(open reading frame 7,ORF7)在稳转细胞系中表达,并且稳转细胞系中ORF7的表达量在感染后12、24和48 h极显著低于普通MARC-145细胞中的表达量(P<0.01)。组织半数感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定进一步证明PRRSV在稳转细胞系中复制能力较低。本研究为进一步开展猪SARM1在PRRSV感染过程中的功能研究提供了基本材料。     

Gln减轻LPS诱导奶牛睾丸支持细胞炎症损伤的作用

谷氨酰胺(glutamine,Gln)可以调节多种抗炎因子的表达,但是其能否减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症损伤不得而知.本研究将传至第3代的奶牛(Bos taurus)睾丸支持细胞(sustentacular cell,SCs)分别与Gln (0.5,1,2,4和8mmol/L)共培养12h,更换培养液培养4h后用试剂盒检测各组细胞存活率,当Gln浓度为2 mmol/L时细胞存活率为90.81％.将培养的睾丸支持细胞随机分为4个组:对照(空白)组、LPS (0.1 μg/mL LPS共培养12 h)组、Gln(2 mmol/L的Gln共培养12 h)组和LPS+Gln(2 mmol/L的Gln共培养12h后用0.1 μg/mL LPS处理4 h)组,用qRT-PCR和Western blot分别检测热体克蛋白72 (heat shock protein 72,HSP72),白介素-1受体相关激酶-M (interkeukin receptor-associatedkinase-M,IRAK-M),Toll作用蛋白(toll-interacting protein,Tollip)和锌指蛋白(zinc finger protein,A20)的表达,用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白介素-6(IL-6),白介素-8(IL-8),白介素-10(IL-10),白介素-13(IL-13)和白介素-17(IL-17)的表达.结果显示,Gln能诱导SCs HSP72、IRAK-M、Tollip和A20的表达,且HSP72mRNA和其蛋白的时效表达量分别在2和4h最高.与空白对照组相比,LPS组细胞的HSP72、IRAK-M、Tollip和A20均显著升高(P＜0.05),与LPS组相比,LPS+Gln组细胞的上述指标均显著降低(P＜0.05).同样,与空白组相比,LPS组细胞IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和IL-17的表达量均显著升高(P＜0.05),与LPS组相比LPS+Gln组细胞的上述相应指标的表达量均显著降低(P＜0.05);上述结果说明,LPS能够诱导炎性因子、HSP72、IRAK-M、Tollip和A20炎症负反馈调节因子的表达.而Gln能够抑制LPS诱导的炎性因子、促进抑炎因子的表达,从而减少炎性损伤.研究结果为进一步筛选抗睾丸炎症的分子药物提供新的理论依据.     

葡萄糖和含腺苷分子通过碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)诱导猪脂肪细胞硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)的表达

硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)是一种氧化还原调节蛋白,通过与硫氧还蛋白结合抑制其活性,调节细胞的氧化还原状态,在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用。本研究利用从3~7日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,应用RNAi沉默碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达,以含0或0.1 mmol/L NAD+的葡萄糖浓度分别为0、5和15 mmol/L的培养液培养,采用实时荧光定量PCR检测Txnip及ChREBP mRNA表达,以探讨葡萄糖和含腺苷分子对猪脂肪细胞Txnip表达的影响及其转录调控途径。结果表明,葡萄糖以浓度依赖方式促进猪脂肪细胞Txnip和ChREBP mRNA表达,无糖条件下NAD+对Txnip mRNA表达没有明显影响,但葡萄糖存在时显著促进其表达。siRNA沉默脂肪细胞ChREBP表达后,葡萄糖对Txnip mRNA表达的促进作用比相同条件下培养的对照细胞有较大幅度降低;以NAD+处理后,Txnip表达在葡萄糖浓度为5和15 mmol/L时分别较对照细胞降低了91%和93%。由此说明,NAD+诱导猪脂肪细胞Txnip转录表达依赖于葡萄糖的参与,ChREBP介导葡萄糖和NAD+对Txnip mRNA表达的诱导作用。研究结果为进一步探讨ChREBP在葡萄糖和脂质稳态中的作用提供了基础。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600 μg/mL)筛选(72 h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株.以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性.结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应.小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P＞0.4为阳性),并且至少可以持续1个月.本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M 融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV 多基因核酸疫苗研制提供了基础资料.